[发明专利]一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用

摘要

一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用，其特征在于ａ．人ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因是从人胶原蛋白十八基因１５０３至２０５５ｃＤＮＡ活性片段通过ＰＣＲ从人肝脏ｃＤＮＡ库中筛选得到；ｂ．人ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因通过内切酶酶切所得到的两种基因片段；ｃ．人ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因及其ｂ项所述２个基因片段通过基因克隆方法在大肠杆菌中表达，具有抑制血管内皮细胞增殖和抗肿瘤血管再生活性而作为生物制品用于治疗实体肿瘤。

主权项

1．一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法，其特征在于：a：人endostatin基因的基因克隆方法是从如附表所示的人胶原蛋白十八(humantypeⅩⅧcollagen)基因1503至2055cDNA活性片段通过PCR方法从人肝脏cDNA库中筛选得到，首先制备两种引物分别为ATTCATATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG和GCCGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人肝脏cDNA库为模板，以PCR条件为94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟共计32个循环而得到人endostatin基因，通过NdeⅠ和BamHⅠ两种内切酶而克隆入PMAL—c2和PET15b、PET9c基因载体，然后在大肠杆菌中表达，纯化得到有活性的重组人endostatin蛋白质；b．采用PstⅠ内切酶从人endostatin基因N末端切去162个核苷酸后得到的基因片段克隆入PMAL—c2基因载体中；采用PstⅠ和SmaⅠ内切酶分别从人endostatin基因N末端和C末端切去162个和264个核苷酸后所得到的基因片段克隆入PET15b和PET9c基因载体中，然后分别在大肠杆菌中表达，纯化得到有活性的两种重组人endostatin蛋白片段。