[发明专利]蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析

摘要

本发明提供一种蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法。所述方法为先用微量的胰蛋白酶酶解蛤蟆油，再通过DEAE阴离子交换色谱柱除去蛋白等杂质，并经透析、冻干、浓缩得到蛤蟆油糖胺聚糖（OR‑GAG）。糖胺聚糖由重复的二糖单元构成，通过肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解OR‑GAG，再利用分子排阻色谱法，得到硫酸乙酰肝素二糖/肝素二糖（HS/HP二糖）。HS/HP二糖经2‑氨基吖啶酮（AMAC）荧光标记后，利用反相色谱柱C18柱进行质谱分析，得到蛤蟆油中各二糖组分的结构与摩尔百分比。最后，建立HS/HP区域结构模型。

主权项

1.蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液；/n（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分；/n（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖；/n（4）分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖；/n（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后得到的二糖经2-氨基吖啶酮和氰基硼氢化钠衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。/n