[发明专利]一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法

摘要

发明先通过对晒醋中的杂菌进行分离纯化后，对分离出的菌种进行针对性培养和产气增粘实验后确认产气和增粘菌，并通过DNA提取和测序构建系统发育树，各菌株鉴定结果为：导致晒醋产气的微生物为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)，导致赤水新工艺晒醋粘度增加的4株微生物分别是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)。

主权项

1.一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，具体包括以下步骤：（1）微生物分离：无菌条件下将产气和变粘稠的晒醋A稀释成10^‑1,吸取0.1‑0.3ml，分别加入装有平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂和乳酸细菌培养基的培养皿中，用无菌涂布棒在培养及表面轻轻涂抹均匀，将培养皿密封，分别倒置于恒温培养箱和厌氧培养箱中，30℃温度下培养3‑5天，以正常晒醋B同样接种到上述培养基中作为对照；（2）纯化：选择菌落数在20‑30之间的平板，用相应的固体培养基进行划线分离纯化3次，纯化后用相应斜面培养基在4℃温度下保存备用；（3）杂菌筛选：将LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中并加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，选择正常的晒醋分装到试管中，加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，将分离纯化的微生物接种到装有培养基和晒醋的试管中，30℃培养3‑5天，观察杜氏小管中是否有气泡和检测培养基的粘度，确定产气和增粘的主要微生物；（4）形态观察和生理化测定：将筛选出的主要微生物进行菌落形态观察及个体形态观察，同时对筛选出的主要微生物进行生理生化实验；（5）基因序列分析：提取实验菌株DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F（5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG‑3’）和反向引物1492R（5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’），在25μL标准反应体系中进行聚合酶连反应扩增；（6）16S rDNA测序：将纯化后的目的基因进行测序，校正后构建系统发育树，具体确定菌株的种属。