[发明专利]一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法

权利要求书

1.一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，具体包括以下步骤：

（1）微生物分离：无菌条件下将产气和变粘稠的晒醋A稀释成10^-1,吸取0.1-0.3ml，分别加入装有平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂和乳酸细菌培养基的培养皿中，用无菌涂布棒在培养及表面轻轻涂抹均匀，将培养皿密封，分别倒置于恒温培养箱和厌氧培养箱中，30℃温度下培养3-5天，以正常晒醋B同样接种到上述培养基中作为对照；

（2）纯化：选择菌落数在20-30之间的平板，用相应的固体培养基进行划线分离纯化3次，纯化后用相应斜面培养基在4℃温度下保存备用；

（3）杂菌筛选：将LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中并加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，选择正常的晒醋分装到试管中，加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，将分离纯化的微生物接种到装有培养基和晒醋的试管中，30℃培养3-5天，观察杜氏小管中是否有气泡和检测培养基的粘度，确定产气和增粘的主要微生物；

（4）形态观察和生理化测定：将筛选出的主要微生物进行菌落形态观察及个体形态观察，同时对筛选出的主要微生物进行生理生化实验；

（5）基因序列分析：提取实验菌株DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3’）和反向引物1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），在25μL标准反应体系中进行聚合酶连反应扩增；

（6）16S rDNA测序：将纯化后的目的基因进行测序，校正后构建系统发育树，具体确定菌株的种属。

2.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养基均购买获得。

3.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（3）所述的黏度检测使用旋转黏度检测计检测。

4.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（4）所述的生理生化实验包括：甲基红实验、过氧化氢酶酶实验 、明胶液化实验 、淀粉水解实验 、硝酸盐还原实验 、柠檬酸盐实验 、石蕊牛奶实验 、葡萄糖发酵实验 、木糖发酵实验 、L-阿拉伯糖发酵实验 、D-甘露醇发酵实验。

5.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（5）所述的反应程序为95℃变性5分钟；95℃变性50秒，56℃复性50秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后于72℃延伸10分钟。