[发明专利]一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法

摘要

本发明提供了一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法，属于RNA提取技术领域。本发明通过改进现有的组织破碎方法，不仅使组织在破碎过程中得到了最大程度地保留，而且还有效避免了组织中RNA的降解；通过CTAB对组织进行高效裂解以及LiCl对RNA进行特异沉淀，实现从微量组织中高效提取高质量总RNA的目的。在本发明实施例中，针对鲜重为0.01g左右的火炬松和马尾松根或菌根组织，均能获得100～300μg/g的总RNA得率，提取得到的总RNA纯度高、完整性好，可满足绝大多数下游研究如转录组建库和测序、RT‑PCR等的要求；样品技术重复间数据一致性好，表明本发明方案稳定、可靠。

主权项

1.一种从微量松根或菌根组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将微量松根或菌根组织置于破碎、裂解专用管中，投入液氮中迅速冷冻，得到经过冷冻的微量组织；所述微量松根或菌根组织的重量为0.009～0.013g；(2)将经过冷冻的所述微量组织置于组织研磨仪上，60Hz研磨30～40s后，重新置于液氮中；(3)向所述破碎、裂解专用管中加入1mL改良CTAB裂解液，涡旋振荡10～20s后65℃温育10～15min，得到温育后的裂解匀浆；每升所述改良CTAB裂解液中包括以下体积百分含量的试剂：2％CTAB，2％PVP，2％β‑巯基乙醇和100mM Tris‑HCl，25mM EDTA和2M NaCl；(4)收集温育后的裂解匀浆与等体积的氯仿/异戊醇混合，涡旋5～10s后，10000g、4℃离心10min；所述氯仿/异戊醇中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；(5)收集离心后的上清液与等体积的氯仿/异戊醇混合，涡旋5～10s后，12000g、4℃再次离心10min；所述氯仿/异戊醇中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；(6)收集再次离心后的上清液与1/2体积的LiCl溶液混合，上下颠倒混匀后于4℃冰箱中沉淀12～16h；所述LiCl溶液的浓度为8M；(7)12000g、4℃离心10min，弃上清得沉淀的总RNA；(8)将所述沉淀的总RNA与体积浓度为70％的乙醇溶液混合洗涤后，10000g、4℃离心5min，弃上清得清洗总RNA；(9)将所述清洗总RNA再与体积浓度为70％的乙醇溶液混合洗涤后，10000g、4℃离心5min，弃上清并干燥，得纯化的总RNA；(10)向所述纯化的总RNA中加入30μL无DNA酶及RNA酶超纯水，得纯化的总RNA溶液。