[发明专利]一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法

说明书

本发明提供了一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法，属于RNA提取技术领域。本发明通过改进现有的组织破碎方法，不仅使组织在破碎过程中得到了最大程度地保留，而且还有效避免了组织中RNA的降解；通过CTAB对组织进行高效裂解以及LiCl对RNA进行特异沉淀，实现从微量组织中高效提取高质量总RNA的目的。在本发明实施例中，针对鲜重为0.01g左右的火炬松和马尾松根或菌根组织，均能获得100～300μg/g的总RNA得率，提取得到的总RNA纯度高、完整性好，可满足绝大多数下游研究如转录组建库和测序、RT‑PCR等的要求；样品技术重复间数据一致性好，表明本发明方案稳定、可靠。

技术领域

本发明属于RNA提取技术领域，具体涉及一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法。

背景技术

松属(Pinus)植物，俗称松树，隶属于松科，是重要的裸子植物类群。松属植物分布广泛，是温带和寒带森林生态系统的重要组分，对森林生态系统的碳封存具有重要贡献。松属植物还是重要外生菌根共生宿主，菌根的形成不仅可以改善松树的矿质营养及水分吸收，还能增强其抗病性与抗逆性，因而对松树的生长发育和生态适应具有重要意义。

松属植物是裸子植物和外生菌根生长发育研究的理想材料，但其根或菌根组织高质量RNA的提取方法还未被提出。现有松属植物的RNA提取方法只在松针、韧皮部等地上组织中进行了验证，这些方法在松根或菌根组织中的提取效果目前还不清楚。相对于地上组织，地下松根或菌根组织材料较难获取。不仅如此，当今生物学研究的精细化趋势也对研究的组织或部位特异性提出了更高的要求，这更增加了获取大量同质材料的难度。因此，如何从有限、特异的组织材料中提取高质量的RNA已成为相关分子生物学研究需要首先解决的技术问题。目前，常规的植物组织总RNA提取通常采用研钵加液氮的破碎方法，研磨及研磨后的组织粉末转移过程都不可避免地存在着部分样品的损失，因此这类提取往往需要较多的起始材料(不少于0.1g)。然而，对于一些取样难度大、特异性要求高的(如根尖、不同发育阶段的菌根组织等)精细生物学研究，往往很难收集到足够的生物学材料。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从微量松根或菌根组织中提取高质量总RNA的方法，具有所需起始材料少、RNA得率及纯度高、RNA完整性好等优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种从微量松根或菌根组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

(1)将微量松根或菌根组织置于破碎、裂解专用管中，投入液氮中迅速冷冻，得到经过冷冻的微量组织；所述微量松根或菌根组织的重量为0.009～0.013g；

(2)将经过冷冻的所述微量组织置于组织研磨仪上，60Hz研磨30～40s后，重新置于液氮中；

(3)向所述破碎、裂解专用管中加入1mL改良CTAB裂解液，涡旋振荡10～20s后65℃温育10～15min，得到温育后的裂解匀浆；每升所述改良CTAB裂解液中包括以下体积百分含量的试剂：2％CTAB，2％PVP，2％β-巯基乙醇和100mM Tris-HCl，25mM EDTA和2M NaCl；

(4)收集温育后的裂解匀浆与等体积的氯仿/异戊醇混合，涡旋5～10s后，10000g、4℃离心10min；所述氯仿/异戊醇中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；

(5)收集离心后的上清液与等体积的氯仿/异戊醇混合，涡旋5～10s后，12000g、4℃再次离心10min；所述氯仿/异戊醇中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；

(6)收集再次离心后的上清液与1/2体积的LiCl溶液混合，上下颠倒混匀后于4℃冰箱中沉淀12～16h；所述LiCl溶液的浓度为8M；

(7)12000g、4℃离心10min，弃上清得沉淀的总RNA；