[发明专利]用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的注射剂及使用方法在审
| 申请号： | 201910449512.9 | 申请日： | 2019-05-28 |
| 公开（公告）号： | CN110157743A | 公开（公告）日： | 2019-08-23 |
| 发明（设计）人： | 刘志峰;马爱军;张金生;赵亭亭;杨双双;杨敬昆;曲江波 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 |
| 主分类号： | C12N15/89 | 分类号： | C12N15/89;C12N15/113 |
| 代理公司： | 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) 11427 | 代理人： | 彭友谊 |
| 地址： | 266071 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种用于敲低大菱鲆14‑3‑3基因表达的注射剂及使用方法，属于分子生物学领域，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：(1)基因主表达组织RNA提取，(2)dsRNA的制备：根据目的基因的CDS序列，设计特异性引物合成DNA产物片段。以步骤(1)提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR获得目的DNA片段，将DNA产物回收，以回收产物为模板，合成dsRNA，使用生理盐水稀释合成的dsRNA，其有效浓度为4ug/g，通过多点注射的方式，分2‑4次注射到鱼体背部肌肉中。本发明注射剂能够实现直接在鱼类个体水平上进行基因敲降，以便于研究大菱鲆14‑3‑3基因的功能。 | ||
| 搜索关键词： | 注射剂 大菱鲆 基因表达 制备 基因 合成 分子生物学领域 生理盐水稀释 反转录合成 特异性引物 背部肌肉 产物片段 多点注射 个体水平 回收产物 目的基因 有效浓度 合成DNA 鱼体 鱼类 注射 回收 研究 | ||
【主权项】：
1.一种用于敲低大菱鲆14‑3‑3基因表达的dsRNA注射剂，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：(1)基因主表达组织RNA提取：提取大菱鲆鳃组织的RNA；(2)dsRNA的制备：根据目的基因的CDS序列，设计特异性引物合成DNA产物片段，产物控制在300‑800bp之间，上下游引物的5’端均需加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG；IR1F TAATACGACTCACTATAGGGG CACGAATCGCTTGCCACT，IR1R TAATACGACTCACTATAGGGAC GGAGAAGTTCAGAGCAAGG；使用这对引物，以步骤(1)提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR获得目的DNA片段，将DNA产物回收，凝胶检测，并对其进行测序以确认合成片段的特异性，以回收产物为模板，合成dsRNA，使用Nanodrop 2000以及凝胶检测dsRNA质量与浓度。
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