[发明专利]提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法

摘要

本发明提供一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法，通过添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)减少CAR‑T细胞活化信号传递，抑制了CAR‑T细胞的终末分化，提高了CAR‑T细胞制品中的初始T细胞和中心记忆T细胞的比例，同时抑制CAR‑T细胞的耗竭倾向。本发明方法解决了体外培养过程中CAR‑T细胞的终末分化和耗竭倾向的难题。本发明方法培养过程简单易行，成本低廉，临床应用安全可靠；培养得到的CAR‑T细胞初始T细胞和中心记忆T细胞比例高，并避免了CAR‑T细胞的耗竭倾向，重复性好；培养得到的CAR‑T细胞展现出更好的治疗疗效和体内维持持久性，具有广泛的应用推广价值。

主权项

1.一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)外周血单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞；(2)CD3(+)T细胞富集及T细胞激活：使用anti‑CD3/CD28磁珠，与外周血单个核细胞充分混匀并结合于CD3(+)T细胞后，予磁力架富集CD3(+)T细胞，并同时利用结合在磁珠表面的anti‑CD3/CD28抗体激活CD3(+)T细胞；(3)携带靶向CD19的CAR慢病毒转染T细胞：将已制备好的携带靶向CD19的CAR的慢病毒按照MOI＝10转染anti‑CD3/CD28磁珠活化的CD3(+)T细胞；(4)添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼扩大培养CAR‑T细胞取培养3‑5天的CAR‑T细胞，流式检测CAR分子的表达，确认CAR‑T细胞制备成功后，将CAR‑T细胞分2组分别连续培养9天；(5)CAR‑T细胞亚群检测：培养第9天取样本标记荧光抗体CD45RO、CD62L，流式细胞仪检测CAR‑T细胞亚群；(6)CAR‑T细胞耗竭相关表面分子的检测培养第9天取样本标记荧光抗体PD1、TIM3、LAG3，流式细胞仪检测CAR‑T细胞耗竭相关表面分子；(7)评估经达沙替尼处理的CAR‑T细胞疗效及持久性分对照组和实验组，对照组用DMSO处理的CAR‑T细胞，实验组用达沙替尼30nM培养的CAR‑T细胞，通过成像仪比较两组肿瘤负荷差异，通过流式细胞术检测CAR‑T细胞比例，绘制生存曲线。