[发明专利]利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法

摘要

本发明涉及一种利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，该方法包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：采用体外原代细胞培养，二次网筛法提取2~3代人子宫内膜基质细胞；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间；⑶CCK8法筛选BBR作用于细胞的适宜浓度及时间；⑷ELISA检测IL‑1β、TNF‑α的含量；⑸数据分析。本发明通过CCK8法检测不同浓度梯度LPS和BBR在不同时间作用下对hESCs的毒性作用，并用ELISA鉴定LPS诱导的炎症模型，从而确定黄连素对人子宫内膜炎有一定的疗效，是治疗子宫内膜炎的潜在药物。

主权项

1.利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：①从盛有无菌生理盐水的标本瓶中取出人子宫内膜组织，用PBS清洗该人子宫内膜组织2~3遍，并用眼科剪将组织剪碎至直径＜1mm；②将所述步骤①所得的内膜组织移至15 mL离心管中，加入5~7 mL IV型胶原酶，于37℃水浴锅中消化40~60 min，每隔10 min摇晃一次离心管，直至组织变为絮状；再加入5~7 mL的DMEM/F‑12完全培养液终止消化；③依次用100目筛网、400目滤网过滤，所得的滤液即为含间质细胞的细胞悬液；④将所述含间质细胞的细胞悬液1200r/min离心5min，弃上清，即得混有红细胞的间质细胞团；⑤所述混有红细胞的间质细胞团中加入DMEM/F‑12完全培养液吹打均匀，移入培养皿，于37℃、5% CO₂培养箱中培养，第二天换液；⑥待所述步骤⑤所得的细胞铺满培养皿后，弃掉培养液，用PBS冲洗该细胞；然后加入0.25% 胰蛋白酶消化液1mL消化细胞，于37℃、5% CO₂培养箱中消化1min，在倒置显微镜下观察，当大多数细胞由梭形变为圆形，细胞间隙扩大时，加入1mL DMEM/F‑12完全培养液终止消化；⑦反复吹打所述步骤⑥所得的细胞，以1：3的比例接种于DMEM/F‑12完全培养液，并放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中进行培养，隔天换液；⑧待所述步骤⑦所得的细胞铺满培养皿后，重复步骤⑥~⑦，直至得到2~3代人子宫内膜基质细胞；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间：ⅰ接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞，采用0.25% 胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F‑12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养；ⅱ饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F‑12培养液饥饿12h；ⅲ将10 mg/mL LPS试剂分别稀释成浓度为0、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400μg/mL的LPS；ⅳ弃去原培养液，分别加入含0、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F‑12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；ⅴ将CCK8与不含FBS的DMEM/F‑12培养液按1:10的体积比配制，LPS分别作用ESC细胞24、48h 后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F‑12培养液；ⅵ将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；ⅶ按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组‑OD空白组）/（OD对照组‑OD空白组）×100%；⑶CCK8法筛选BBR作用于细胞的适宜浓度及时间：a接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞，采用0.25% 胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F‑12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养；b饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F‑12培养液饥饿12h；c将2 mg/mL BBR试剂分别稀释成浓度为0、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40μg/mL的LPS；d弃去原培养液，分别加入含0、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F‑12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；e将CCK8与不含FBS的DMEM/F‑12培养液按1:10的体积比配制，BBR分别作用ESC细胞12、24、48h 后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F‑12培养液；f将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；g按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组‑OD空白组）/（OD对照组‑OD空白组）×100%；⑷ELISA检测IL‑1β、TNF‑α的含量；⑸数据分析。