[发明专利]一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法

摘要

本发明公开了一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法。该方法包括如下步骤：先用裂解细菌菌体的试剂、溶菌酶和葡萄球菌酶裂解细菌菌体，并采用玻璃粉进行物理破壁，使金黄色葡萄球菌菌体充分裂解，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；高速离心分离，取上清液转移至吸附柱中，进行吸附离心，富集质粒DNA；加入漂洗液进行脱盐离心，加入超纯水洗脱离心，得到质粒DNA。本发明的方法同时采用物理和化学方法提高了金黄色葡萄球菌的破壁效率，节约成本，提高了质粒提取过程中质粒的回收率。

主权项

1.一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；（3）将步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；（6）将步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5‑10次，得到混合液；（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5‑10次，然后室温静置10‑15分钟，其间每隔2‑3分钟颠倒混匀5‑10次得到含蛋白酶K的混合液；（9）将快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10‑15次，得到悬浊液；（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（14）重复步骤（13）；（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到一次洗脱液，一次洗脱液中含有所述目的质粒；（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液；（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液放在冰箱中冷藏保存。