[发明专利]一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法

摘要

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法，包括如下步骤：用单个核细胞分离管和Percoll分层液从成人外周血中分离出单个核细胞和自体血清，将单个核细胞在外周血淋巴细胞培养基上进行体外培养；对体外培养的单个核细胞分瓶，1号培养瓶用OKT3抗体、OKT28抗体及细胞因子活化剌激，2号培养瓶中加入自体肿瘤抗原、细胞因子和TLR7激动剂培养后，然后合瓶培养，能有效地提高特异性效应细胞群活化效率和扩增效率。本发明充分运用自体肿瘤抗原和过程产物自体血清，对自体肿瘤细胞的杀伤更有针对性，以蠕动泵补充培养基为淋巴细胞扩增创造最优条件，所获得的淋巴细胞亚群具有特异性高杀伤肿瘤细胞的能力。

主权项

1.一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用单个核细胞分离管和Percoll分层液从成人外周血中分离出单个核细胞和自体血清，将单个核细胞在外周血淋巴细胞培养基上进行体外培养；(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化剌激：将步骤(1)的单个核细胞培养2小时后分瓶进行特异性刺激活化。继续培养24小时后，培养瓶2加入OKT3抗体终浓度为90～100ng/ml，OKT28抗体终浓度为90～100ng/ml，IL‑2终浓度为900～1000IU/ml，GM‑CSF终浓度为450～500U/ml，IL‑1a终浓度为950～100IU/mL；培养瓶1加入加入GM‑CSF终浓度为950～1000U/ml，IL‑4终浓度为950～1000U/ml，37℃、5.0％CO 2条件下继续培养；继续培养48小时后加入自体肿瘤抗原30～40ug/ml，继续培养24小时后加入TLR7激动剂终浓度为8～12ng/ml，继续培养24小时后加入IL‑1β，终浓度为8～10ng/ml；PGE2终浓度为450～500ng/ml；继续培养24小时后加入TNF‑α，终浓度为8～10ng/ml，诱导细胞活化；继续培养24小时后合瓶；(3)每个培养瓶用液位计实时探测液面高度，用蠕动泵及时补充震荡混匀的比例为1:1的自体血清和外周血淋巴细胞培养基，每48小时更换一半培养基，将细胞密度保持为1.2×10⁶～1.8×10⁶/ml，合瓶培养7天后，获得具特异性高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群；所述步骤(1)中的用外周血淋巴细胞培养基，每毫升含有如下组分，RPMI‑1460培养基0.6‑0.8ml、胎牛血清0.2‑0.3ml、庆大霉素200‑500ng、L‑谷氨酰胺300‑500ng、植物凝集素(PHA)600‑800ng。