[发明专利]一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法

摘要

本发明公开了一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，它包含如下步骤：一、剪取胎盘底蜕膜面的组织，剪成肉泥，放入胞培养瓶中进行传代培养；二、取细胞悬浮液到新的离心管中离心5min；收集下层沉淀，加入传代培养基；三、细胞生长后冻融裂解得细胞混合液，将细胞混合液离心处理；四、取上清液于新的无菌离心管中，低温保存；五、制备5％阿拉伯胶壁材溶液；六、制备1％壳聚糖壁材溶液；制备W/O型乳状液；七、制备W/O/W型乳状液；八、复凝聚反应；九、固化反应；十、冷冻得到胎盘间充质干细胞微胶囊；本发明将活性物质制备成微胶囊进行保护，减小温度、光照等因素对活性物质的影响，达到常温储存的要求。

主权项

1.一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于它包含如下步骤：一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，剪取胎盘底蜕膜面的组织；二、在无菌室挑取颜色鲜亮的组织，剪成肉泥；三、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm²的细胞培养瓶中，做好标记；四、将细胞培养瓶倒扣，缓慢加入无血清培养基，放入37℃培养箱中，向培养箱中充入5％的CO₂，倒置2h，拧紧瓶盖；五、将细胞培养瓶正置，确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；六、三天后观察组织块，观察时动作要轻，尽量不要晃动；七、七天后再半量换液，此后均半量换液；八、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；九、将培养液去除，生理盐水冲洗一遍，加入2mL的0.25％Trypsin‑EDTA(1X)，放入37℃培养箱中，约3‑5min，待细胞变圆时，停止消化，弃去消化液，加入无血清培养基至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞悬浮液到新的离心管中，离心5min，转速为1500rpm；十、弃去上层溶液，收集下层沉淀，加入传代培养基，按着1×105个/mL细胞量进行传代培养；十一、待细胞生长至80‑90％密度时，收获细胞；计数，取1×108胎盘间充质干细胞，加入预冷的50mL灭菌去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，其它细胞液氮中冷冻保藏；十二、根据需要冻存的细胞数，在50mL离心管中加入若干毫升的细胞冻存重悬细胞；十三、将冻存的细胞均分到若干个2mL的冻存管中，每管加细胞悬液1mL，将冻存管盖拧紧盖好；十四、将冻存管置于已平衡到4℃的程序降温盒中，移至‑80℃冰箱逐级降温‑80℃；十五、从程序降温盒中取出冻存管，迅速移至液氮中长期冻存备用；十六、取第十一步骤中裂解后的细胞混合液，在4℃的温度下离心10min1转速为10000rpm；吸取含有活性物质的上清液于新的无菌离心管中，定容至100mL，低温保存备用；十七、称取5g阿拉伯胶及100g去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解，得到5％阿拉伯胶壁材溶液；十八、称取1g壳聚糖及100g去离子水，在50℃水浴中搅拌溶解，得到1％壳聚糖壁材溶液；十九、将步骤十六中低温保存的上清液加入花生油中，上清液与花生油的体积比为1:3，在35℃的温度下高速分散乳化40min，转速为10000rpm，得到均一的W/O型乳状液；二十、将W/O型乳状液加入5％阿拉伯胶中，W/O型乳状液与5％阿拉伯胶的体积为比1:4，在35℃的温度下高速分散乳化30min1转速为10000rpm，得到均一的W/O/W型乳状液；二十一、将上述W/O/W型乳状液加入1％壳聚糖中；W/O/W型乳状液与1％壳聚糖的体积比为1:1，恒温匀速搅拌条件下，用1mol/LHCl溶液和0.1g/mLNaOH调节PH至4‑5；在25℃的温度下高速分散乳化30min，转速为10000rpm，使阿拉伯胶与壳聚糖发生复凝聚作用；二十二、室温条件下，固化4h；二十三、真空冷冻干燥机预冷至‑45℃后开始抽真空，控制在80Kpa，冷冻时间8h，得到胎盘间充质干细胞微胶囊。