[发明专利]一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的方法有效
| 申请号： | 201811607611.7 | 申请日： | 2018-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN109439684B | 公开（公告）日： | 2023-09-01 |
| 发明（设计）人： | 张小飞;竺伟 | 申请（专利权）人： | 尚科生物医药（上海）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 201318 上海市浦*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，属于分子生物学技术领域。当前，在真核细胞中表达外源基因存在着操作繁琐、周期较长、成本较高和库容量较低等弊端，严重限制在真核细胞中的进化效率。本发明通过基因重组双点交换原理，利用重叠延伸PCR技术，仅需要200ng突变的线性DNA片段，通过电击转化就可以获得106个/ug的突变库容量，同时周期由原来的72h缩减到4h内完成，中间过程也省去了转入细菌复制和限制性内切酶消化的繁琐操作步骤。本发明的方法步骤简便、经济、高效，为生物酶在真核细胞中的进化提供了高效的操作方法，加快了真核细胞中表达的蛋白酶在医药领域的应用。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 提高 基因 真核细胞 进化 效率 方法 | ||
【主权项】：
1.一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(I)以穿梭重组质粒为模板构建两对引物，引物对P1/P2和引物对P3/P4；(II)以P1/P2为一对引物，扩增出上游片段P1P2；以P3/P4为另一对引物，扩增出下游片段P3P4；(III)利用重叠延伸PCR方法，在P1/P4为一对引物的作用下，扩增出整个重组基因片段P1P4；(IV)将扩增产物利用脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，加入预冷1M山梨醇，置于37℃孵育1h，之后的转化液涂布于含有抗性的YPD平板上，等待单克隆的长出。
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