[发明专利]一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的方法

说明书

本发明涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，属于分子生物学技术领域。当前，在真核细胞中表达外源基因存在着操作繁琐、周期较长、成本较高和库容量较低等弊端，严重限制在真核细胞中的进化效率。本发明通过基因重组双点交换原理，利用重叠延伸PCR技术，仅需要200ng突变的线性DNA片段，通过电击转化就可以获得106个/ug的突变库容量，同时周期由原来的72h缩减到4h内完成，中间过程也省去了转入细菌复制和限制性内切酶消化的繁琐操作步骤。本发明的方法步骤简便、经济、高效，为生物酶在真核细胞中的进化提供了高效的操作方法，加快了真核细胞中表达的蛋白酶在医药领域的应用。

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法。

背景技术：

随着生物酶法在化学转化中的应用，使得部分手性医药中间体的合成变得容易。但现有的大部分生物酶不能满足需求，特别是来自细菌表达的蛋白，缺乏一定的翻译后修饰，导致错误折叠或直接以不可溶的形式存在，这也使得真核细胞成为了生物酶表达的重要场所。在真核细胞中酵母是最简单的一种以单细胞存在的生物，尤其是毕赤酵母。毕赤酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，具有真核细胞翻译后修饰、生长快速、无毒素产生等特点，成为各研究学者的首选对象。特别是甲醇营养型的毕赤酵母表达系统，它具有自身分泌蛋白少、糖基化程度低、可使用廉价的无机盐培养基、容易高密度发酵等优点，而得到生产厂家的青睐，用于工业化生产。

尽管毕赤酵母在后期的生产应用上有着重大价值，但作为分子使用的工具，它在操作上有着非常繁琐的过程(见图1A)。首先，外源基因克隆到毕赤酵母的过程中必须要经过细菌的复制过程，通过复制可以提取大量质粒量。根据酵母操作手册要求，转化酵母细胞前需要5～10ug的质粒量，这是细菌转化的千倍用量。其次，获得高浓度的质粒仍需要借助限制性内切酶的消化作用，使质粒线性化后再转入毕赤酵母感受态细胞，整个过程操作顺利，至少需要3天的时间，而且转化后期，时常出现YPD平板上长出的很少克隆。这对于在真核细胞中做定向进化的操作是个严重制约，如果库容量达不到10⁴个/ug，是无法有效完成高容量筛选的操作。另外，突变体基因在经过复制型细菌DH5α富集之后，会使得大量的基因出现重复，导致在后期的筛选中会出现多次获得相同突变的基因，增加筛选难度和工作量。

目前，大量的文献(BioTechniques 36:152-154；Yeast 2004；21:613–617；Yeast2005 22:799–804；Yeast 2008；25:273–278)报道提高库容量的方法，主要是从制备感受态的方法或者电击转化条件入手，并没有从根本上解决真核细胞中的进化效率。

发明内容：

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法。

一种外源基因在真核细胞中高效进化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(I)以穿梭重组质粒为模板构建两对引物，引物对P₁/P₂和引物对P₃/P₄；

(II)以P₁/P₂为一对引物，扩增出上游片段P₁P₂，以P₃/P₄为另一对引物，扩增出片段P₃P₄；

(III)利用重叠延伸PCR方法，在引物对P₁/P₄作用下，扩增出整个重组基因片段P₁P₄；

(IV)将扩增产物利用脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，加入预冷1M山梨醇，置于37℃孵育1h，之后的转化液涂布于含有抗性的YPD平板上，等待单克隆的长出。