[发明专利]鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv-ΔLorf5及其构建方法

摘要

本发明提供了一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv‑ΔLorf5及其构建方法。本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组缺失鸭瘟病毒Lorf5基因，再经过细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无外源碱基和MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题并缺失了MiniF元件，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

主权项

1.鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv‑ΔLorf5的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC‑DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783‑pBAC‑DPV菌株，然后制备GS1783‑pBAC‑DPV感受态；(2)以pEPkan‑S为模板，以GS1783‑BAC‑ΔLorf5‑F和GS1783‑BAC‑ΔLorf5‑R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及Lorf5基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI‑Kana‑Lorf5，切胶回收获得I_SceI‑Kana‑Lorf5片段；(3)将I_SceI‑Kana‑Lorf5片段转化到GS1783‑pBAC‑DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑Lorf5‑Kana；(4)将阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑Lorf5‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉，制备GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5感受态；(5)以pEPkan‑S为模板，以GS1783‑MiniF‑F和GS1783‑MiniF‑R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI‑Kana‑MiniF，切胶回收获得I_SceI‑Kana‑MiniF片段；(6)以CHv基因组为模板，以CHv‑UL23‑F和CHv‑UL23‑R作为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI‑Kana‑MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收获得UL23‑MiniF片段；(7)以I_SceI‑Kana‑MiniF片段和UL23‑MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783‑MiniF‑F和CHv‑UL23‑R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段；(8)将I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段转化到GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23‑Kana；(9)将阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23；(10)从阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23中提取pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23质粒，将pBAC‑DPV‑ΔLorf5‑UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv‑ΔLorf5。