[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

摘要

本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，公开一种猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑的构建方法和应用。以HN‑QYY为亲本毒株，依次缺失gE基因和TK基因，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑；所述猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑缺失了gE基因和TK基因，能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒，为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。

主权项

1.一种猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑的构建方法，其特征在于，步骤如下：S1、缺失gE基因：S1.1、将保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN‑QYY接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN‑QYY病毒基因组DNA，保存备用；S1.2、以变异株HN‑QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL‑f/gEL‑r和gER‑f/gER‑r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；其中，引物序列分别为：gEL‑f：如SEQ ID No.1所示；gEL‑r：如SEQ ID No.2所示；gER‑f：如SEQ ID No.3所示；gER‑r：如SEQ ID No.4所示；S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18‑T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18‑T；S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18‑T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE；S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再次纯化；S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP‑N1载体，回收酶切后的pEGFP‑N1；将回收后的pEGFP‑N1连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE‑EGFP；S1.7、构建重组荧光病毒HN‑QYY‑gE^‑/EGFP⁺将步骤S1.1所得变异株HN‑QYY病毒基因组DNA、pgE‑EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN‑QYY‑gE^‑/EGFP⁺；S1.8、去除绿色荧光基因将HN‑QYY‑gE^‑/EGFP⁺和pcGlobin2‑Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑；S2、缺失TK基因：S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN‑QYY‑gE^‑接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN‑QYY‑gE^‑病毒基因组DNA，保存备用；S2.2、以变异株HN‑QYY‑gE^‑病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL‑f/TKL‑r和TKR‑f/TKR‑r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；其中，引物序列分别为：TKL‑f：如SEQ ID No.5所示；TKL‑r：如SEQ ID No.6所示；TKR‑f：如SEQ ID No.7所示；TKR‑r：如SEQ ID No.8所示；S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18‑T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18‑T；S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18‑T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK；S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再次纯化；S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP‑N1载体，回收酶切后的pEGFP‑N1；将回收后的pEGFP‑N1连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK‑EGFP；S2.7、构建重组荧光病毒HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑/EGFP⁺将步骤S2.1所得变异株HN‑QYY‑gE^‑病毒基因组DNA、pTK‑EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑/EGFP⁺；S2.8、去除绿色荧光基因将HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑/EGFP⁺和pcGlobin2‑Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑。