[发明专利]一种针对加热不燃烧卷烟总粒相物的体外微核检测方法

摘要

本发明公开一种针对加热不燃烧卷烟总粒相物的体外微核检测方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)孵育受试物；(9)收获细胞；(10)低渗；(11)滴片；(12)染色；(13)微核的观察；(14)结果判定。本发明方法能够准确有效地检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞微核率的影响程度，进而确定加热不燃烧卷烟制品的遗传毒性。

主权项

1.一种针对加热不燃烧卷烟总粒相物的体外微核检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；mTPM＝m1‑m0   (1)式中：m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，‑80℃保存待用；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物分组：将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组种植人鼻腔上皮细胞并加RPMI1640细胞培养基；阳性对照组加入1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μL；检测样品组加入步骤(1)所得待测液并加RPMI1640细胞培养基；(6)受试物检测剂量的设定：步骤(1)所得待测液的最终浓度为4个非零剂量，分别为：40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL；(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的培养基，再按步骤(5)进行分组，细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均加入1mg/mL的细胞松弛素B溶液6μL，用RPMI1640细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至2mL/孔；(8)孵育受试物：将步骤(7)加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h；(9)收获细胞：将步骤(8)孵育后的细胞对照组、阳性对照组和检测样品组中加入浓度为0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来；(10)低渗：将步骤(9)消化后的细胞置于离心管内，离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；(11)滴片：将步骤(9)离心管中的上清液移除，加入300μL甲醇冰醋酸溶液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每个检测剂量滴3张玻片；(12)染色：将步骤(9)晾干后的玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，用水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；(13)微核的观察：取染色后所得微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；(14)结果判定：将检测样品组与细胞对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。