[发明专利]一种具有拮抗作用的高纯度放线菌提取液的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有拮抗作用的高纯度放线菌提取液的制备方法，涉及微生物技术领域，包括以下步骤：A：土壤采集、B：样品处理、C：微波处理、D：稀释、E：分离、F：拮抗细菌筛选、G：拮抗细菌复筛、H：扩增、I：检测、J：提取。本发明通过在土壤中提取出放线菌，能够抑制病原菌对太子参和茶树的侵害，避免植物受病原菌侵染后的生长缓慢、肉质根瘦小、产量低和品质差的问题出现，提高了植物的产量，保证了农民的收入，通过提取放线菌来治疗农作物的生长问题，具有无毒无残留、不污染环境等优点，一方面增加了农作物的产量，另一方面对土壤起到了保护作用，有利于生物防治制剂的生产与储存。

主权项

1.一种具有拮抗作用的高纯度放线菌提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A：土壤采集：从太子参和茶树的土地里采集土样若干份，然后将采集后的土样置于无菌信封袋中放置于通风处干燥1‑5天，然后去除小石块和草根；B：样品处理：用天平称取5g经风干过的土壤样品，然后将土壤样品放置于离心管中，在土壤样品的表面稍微喷洒一些无菌水来湿润土壤样品，再静置2‑6min，再把离心管放入盛有600mL自来水的水浴杯中；C：微波处理：再将其置于微波炉中，用灭菌针管吸取无菌水冲洗土壤样品，再转入装有90mL无菌水的广口锥形瓶中，然后放入摇床中震荡10‑30min，最后再静置10‑20min；D：稀释：称取10g的土壤样品倒入锥形瓶中，放入摇床中震荡20‑40min，用无菌纸浆震荡处理后的样品过滤，再用0.1mL的无菌吸管吸取10‑1稀释液；E：分离：制备好土壤稀释液后，将稀释液加入到已经灭好菌的培养基中，再将培养基倒入已灭菌的培养皿中，待培养基稍微凉了后，往培养基中加入重铬酸钾溶液以抑制细菌和真菌的生长，待培养基彻底凝固后，用移液枪分别吸取100uL浓度为10‑3、10‑4和10‑5的土壤悬液放置于无菌板上，用无菌涂布分别涂抹均匀，并且在每个平板上做好记号，静置20‑40min后将平板倒置在培养箱中培养10‑20天；F：拮抗细菌筛选：在PDA培养基平板中央接入一块5mm直径的供试炭疽病原菌菌株，生长1‑3天后在四周距离2cm处接入LB培养基平板上的单菌落，3天后观察测量抑菌圈的大小，筛选拮抗细菌菌落；G：拮抗细菌复筛：在PDA培养基平板中央接入一块5mm直径的供试炭疽菌菌株，生长1‑3天后在四周距离2cm处接入LB培养基平板上的单菌落，作为单皿多次重复抑制试验，3天后观察抑菌距离的宽度，筛选出纯种拮抗细菌；H：扩增：将具有拮抗作用拮抗菌在LB固体培养基上划线稀释，挑取单菌落与LB液体的培养基中混匀，作为PCR体系模板；I：检测：分别取4μL扩增后的产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，若条带清晰，并且产物条带显示的分子量与预期大小一致，则视为合格；J：提取：将合格的培养液进行成分提取。