[发明专利]一种纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌原生质体融合的方法

摘要

本发明公开了一种纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌原生质体融合的方法，包括如下步骤：两亲株原生质体的制备、菌体的筛选标记、原生质体融合。本发明优化了原生质体制备过程中溶菌酶浓度和酶解时间，以提高原生质体形成率和再生率；并通过采用PEG法与电击法相结合的方法来进行原生质体的融合，优化了PEG的浓度、PEG处理的温度和时间、电击融合的条件和时间等，提高了种间芽孢杆菌原生质体融合率，得到的融合子经过筛选，最终得到高产抗菌脂肽的融合菌株，能广泛应用于生物制药、农业、畜牧业等行业。

主权项

1.一种纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌原生质体融合的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.两亲株原生质体的制备：向纳豆芽孢杆菌菌液中加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为0.25～0.5mg/mL，于30～37℃酶解15～25min；向暹罗芽孢杆菌菌液中加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为0.2～0.5mg/mL，于30～37℃酶解20～30min；离心收集酶解后的两种菌体，洗涤后即得两亲株原生质体；S2.菌体的筛选标记：将纳豆芽孢杆菌原生质体在紫外灯条件下照射70～80min进行灭活，暹罗芽孢杆菌在80℃～95℃下处理30～45min进行灭活；S3.原生质体融合：取等量灭活的两亲株原生质体混合5min，离心收集菌体；加入200μL 0.2mol/L的CaCl2溶液混匀菌体，再加入pH=9的30～50% PEG6000于35～37℃预融合10～15min；再将预融合液进行电击融合，所述电击融合的条件为脉冲融合电压400～800V、脉冲宽度45～55us、脉冲个数2～4个；将电击融合后的融合液于35～37℃进行后融合5～10min；收集菌体并洗涤，涂布于再生平板上培养24h即得融合子。