[发明专利]一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程

摘要

本发明公开了一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程；具体流程包括：1)人多能干细胞培养于基质胶包被的培养板；2)ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化；3)分化的第二阶段为腹部前肠内胚层阶段；4)分化的第三个阶段为肺系分化阶段；5)41天的诱导；本发明提供的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，本诱导分化流程为目前最经济，仅用5种细胞因子/小分子化合物的3D肺类器官定向分化平台。

主权项

1.一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：具体流程包括：1)人多能干细胞培养于基质胶包被的培养板，培养基为多能干细胞专用培养基；2)ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化，分化第一个阶段为定型内胚层阶段，诱导培养基为RPMI1640基础培养基含100ng/ml的活化素A，每天跟换诱导培养基，DE阶段持续3天，ESC/iPSC进入DE阶段，应表达DE阶段特异性标志物SOX17和FOXA2，同时下调多能性标志物OCT4；3)分化的第二阶段为腹部前肠内胚层阶段，诱导培养基为Advanced‑DMEM/F12基础培养基含200ng/ml Noggin,500ng/ml FGF4,10μM SB431542和2μM CHIR99021，每天跟换诱导培养基，AFE阶段持续4天；4)分化的第三个阶段为肺系分化阶段，诱导培养基为含1％FBS Advanced‑DMEM/F12培养基，细胞经过DE和AFE阶段共7天的诱导后，PBS洗2次，酶,消化3分钟,1％FBS Advanced‑DMEM/F12培养基中和，1000转离心，弃去上清，细胞包埋于预冷的基质胶中,37℃，5％CO2培养箱中静置30分钟，待基质胶固化后加入含1％FBS Advanced‑DMEM/F12培养基，每3天跟换培养基，6‑8天传代一次，诱导35天；5)经过41天的诱导，形成3D立体结构的肺类器官，表达多种肺系标志物，同时电镜应能看到“9+2”微管结构，即肺近端纤毛细胞特异结构。