[发明专利]一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法在审
| 申请号： | 201811103634.4 | 申请日： | 2018-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN109182254A | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 张明;张鹏飞;黄愉淋;侯振 | 申请（专利权）人： | 广西大学 |
| 主分类号： | C12N5/076 | 分类号： | C12N5/076;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京华仁联合知识产权代理有限公司 11588 | 代理人： | 苏雪雪 |
| 地址： | 530000 广西壮族*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | 本发明属于精子细胞处理技术领域，具体涉及一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其主要包括以下步骤：1)获得水牛睾丸，用胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I组合酶法消化，细胞筛过滤，差异贴壁后取悬浮细胞；2)取悬浮细胞进行活细胞染色；3)流式细胞仪分选。有益效果：本技术方案为行之有效的水牛精子细胞分离方法，通过使用双酶法分解牛睾丸组织，得到单细胞悬液，采用连续差异贴壁法去除体细胞的干扰，再采用流式细胞仪根据未贴壁细胞染色后的荧光强弱，判断细胞DNA含量，有效消化和去除了二倍体精原细胞和四倍体初级经母细胞等其他非目标细胞的干扰，实现大量单倍体精子细胞的成功分选。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞分离 水牛 流式细胞仪 悬浮细胞 睾丸精子 分选 贴壁 单倍体精子细胞 单细胞悬液 活细胞染色 透明质酸酶 未贴壁细胞 胶原酶IV 精原细胞 精子细胞 连续差异 目标细胞 水牛精子 荧光强弱 有效消化 睾丸组织 细胞DNA 二倍体 母细胞 双酶法 四倍体 体细胞 细胞筛 组合酶 染色 睾丸 去除 过滤 分解 消化 成功 | ||
【主权项】：
1.一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：1)获得水牛睾丸，用胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I消化，细胞筛过滤，差异贴壁后收集悬浮细胞；2)取悬浮细胞进行活细胞染色；3)采用流式细胞仪根据细胞形态和染色情况进行分选，获得水牛精子细胞；4)对获得水牛精子细胞进行鉴定。
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- 2018-03-15 - 2018-09-28 - C12N5/076
- 本发明公开了一种猪精子培养基及其制备方法，包括如下成份:无水葡萄糖:18‑20g、柠檬酸三钠6‑7g、tris6‑7g、EDTA 7‑8g、碳酸氢钠1‑2g，CMC 0.1‑1g、抗结剂0.1‑1g、氯化钾0.1‑1g、柠檬酸3‑4g、半胱氨酸0.1‑1g、GHS 0.01‑0.1g、糜蛋白酶0.01‑0.05g、褪黑激素0.01‑0.05g、溶菌酶0.01‑0.1g、聚维酮碘0.01‑0.05g，本发明一种猪精子培养基及其制备方法操作制作简单先准备一份给三次蒸馏的蒸馏水1000ml，将上述培养基46g放入其中，用磁力搅拌器让其充分溶解，静置1‑2小时使可制成，且各材料成本低。
- 人类Y精子的筛选方法-201810157258.0
- 山下直树;中田久美子 - 山下直树
- 2018-02-24 - 2018-09-14 - C12N5/076
- 本发明涉及人类Y精子的筛选方法。本发明的课题在于，提供对精子造成的损伤少、且可比较简便地对Y精子进行筛选的方法等。本发明的解决手段为：测定人类精子在含有透明质酸酶、孕酮及聚乙烯吡咯烷酮的生理性水溶液中的运动速度，检测该精子尾部的弯曲状态，筛选运动速度更快、且尾部弯曲程度低、尾部鞭打频率小的精子作为Y精子。
- 睾丸穿刺精子的培养液-201810262754.2
- 许常龙 - 南宁市第二人民医院
- 2018-03-28 - 2018-07-24 - C12N5/076
- 本发明公开一种睾丸穿刺精子的培养液，由以下原料配制而成：NaCl 5.4～5.6 g/L、KCl 0.3～0.4 g/L、CaCl2﹒2H2O 0.2～0.4 g/L、KH2PO4 0.1～0.3g/L、MgSO4﹒7H2O 0.2～0.3 g/L、NaHCO3 0.3～0.4 g/L、HEPES 4.5～5g/L、乳酸钠2.5～3 g/L、丙酮酸钠0.02～0.04 g/L、己酮可可碱2～3mmol/L、葡萄糖1～2 g/L、BSA 3～4 g/L、青霉素0.05～0.08 g/L、链霉素0.02～0.06 g/L、酚红0.01～0.02 g/L、PVA 1～1.5‰，本发明能有效改善弱精子症和精子无力症，利于优质精子的挑选，提高授精质量。
- 一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法-201510347492.6
- 李向东;姚建飞 - 中国农业大学
- 2015-06-19 - 2018-07-06 - C12N5/076
- 本发明涉及细胞工程领域，具体提供一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法，包括如下步骤：(1)培养胶块的制备：将1.2％的琼脂糖胶切块置于6孔板中，加入培养基浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，此时的琼脂糖胶块用作培养胶块；所述培养基的成分及含量为：90％MEMα+10％KSR；(2)取新生5.5天和新生10.5‑12.5天的小鼠睾丸，去外层白膜，分割成块状组织样品；(3)将组织样品置于前述的培养胶块上，将6孔板置于细胞培养箱中进行培养；(4)新生5.5天的小鼠睾丸组织培养22‑25天得到圆形精子；新生10.5‑12.5天的小鼠睾丸组织培养27天左右得到长形精子。
- 一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法-201810081176.2
- 郭红刚;褚晓峰;李莉;卢领群;杜江涛;石巧娟;戴方伟;应华忠 - 浙江省医学科学院;杭州市疾病预防控制中心
- 2018-01-29 - 2018-06-12 - C12N5/076
- 本发明公开了一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法。一种精子体外获能液，包括NaCl 110～140mmol、KCl 2.40～2.95mmol、NaHCO3 22.5～27.5mmol、葡萄糖4.8～6.0mmol、丙酮酸钠0.22～0.30mmol、牛磺酸0.22～0.30mmol、肾上腺素0.04～0.06mmol、BSA 14～16mg/ml、MgCl2 0.4～0.6mmol、CaCl2 1.6～2.0mmol、DL‑乳酸钠溶液8～12mmol，pH值为7.35±0.10。本发明精子体外获能液能够显著提高长爪沙鼠在体外受精效率，使用本发明方法后长爪沙鼠在体外受精效率大大提高，2细胞发育率达到65％以上，最高可以达到85％，取得了与显微注射方法相当甚至更高的体外受精率，使用方便，具有很好的应用前景。
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