[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用

摘要

本发明提供一种地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌DW2的基因组内成功敲除碳代谢转录因子PhoP的基因—phoP，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP的杆菌肽产量提高了15％以上。

主权项

1.敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；（2）通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；（3）采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；（4）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒 T2(2)‑ori进行双酶切得到线性质粒片段；（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)‑ΔphoP；（6）将敲除质粒T2(2)‑ΔphoP转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（8）挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了phoP基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的phoP基因为SEQUENCE LISTING中所示。