[发明专利]一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法

摘要

本发明公开了一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，包括Klotho相互作用蛋白的筛选、Rab8与Klotho基因相互结合的验证、Rab8与Klotho相互作用的机制分析这三步骤。本发明首次发现，非小细胞肺癌细胞中Rab8与Klotho存在相互结合，在亚细胞中存在共定位，Rab8通过蛋白合成后途径，与Klotho结合并以囊泡形式促进其向膜表面转运，从而提高膜表面Klotho分布水平。

主权项

1.一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：a、Klotho相互作用蛋白的筛选利用载体质粒pUltra或pUltra‑Klotho、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2G共转染293T细胞，利用流式细胞仪对病毒滴度进行分析，得到Klotho慢病毒表达载体Lenti‑FLAG‑Klotho，利用Lenti‑FLAG‑Klotho感染肺腺癌细胞系A549，以Lenti‑FLAG‑GFP为对照，对提取的蛋白进行免疫共沉淀实验，筛选与Klotho高概率结合的蛋白，最终挑选出20个蛋白评分超过60分的Rab家族成员，其中Rab8蛋白评分最高；b、Rab8与Klotho蛋白相互结合的验证，包括外源性和内源性免疫共沉淀实验外源性免疫共沉淀通过FLAG‑Klotho和HA‑Rab8共转染HEK293细胞，然后利用标签抗体进行免疫共沉淀实验分析二者的相关性，结果显示Klotho和Rab8二者相互结合；内源性免疫共沉淀通过将A549细胞裂解，进行Rab8/Klotho免疫共沉淀实验，结果显示生理条件下内源性Rab8和Klotho蛋白也存在相互结合；c、Rab8与Klotho相互作用的机制分析（1）观察Klotho和Rab8亚细胞定位情况通过免疫荧光细胞化学方法观察Klotho与Rab8在A549细胞中的亚细胞共定位情况，结果发现Klotho与Rab8在亚细胞中存在共定位；（2）分析Rab8表达变化对Klotho表达的影响构建Rab8干扰序列siRNAs，具体序列如下：Rab8 siRNA1# (siRab8‑1): 5'‑ CGAGAAGTCCTTCGACAACAT ‑3';Rab8 siRNA2# (siRab8‑2): 5'‑ CGGAACTGGATTCGCAACATT ‑3';Rab8 siRNA3# (siRab8‑3): 5'‑ TCGCCAGAGATATCAAAGCAA ‑3';Rab8 siRNA阴性对照 (siNC): 5'‑ ATGTTGTCGAAGGACTTCTCG ‑3';分别将上述siRab8转染A549细胞，评估干扰效率，结果提示siRab8‑3干扰效率最高，为91%，利用siRab8‑3 或Rab8过表达质粒Myc‑Rab8转染A549细胞，并分别通过Western blot和qRT‑PCR检测Klotho的蛋白和mRNA水平变化，结果提示，Rab8表达变化并不影响Klotho总蛋白或mRNA表达水平；（3）观察Rab8对Klotho膜表面表达的影响利用生物素表面标记技术，对A549和H1299细胞系中Rab8是否参与Klotho的膜表面转运进行了研究，实验结果发现，活化形式突变体Rab8Q67L可显著提高肺癌细胞膜表面Klotho表达水平，而失活形式突变体Rab8T22N和siRab8则使Klotho膜表面表达水平明显降低；（4）分析Klotho的定位与其蛋白代谢的关系将不同活化形式的Rab8，即Rab8Q67L、Rab8WT和Rab8T22N分别转染A549细胞，并利用蛋白翻译抑制剂放线菌酮CHX阻断Klotho生物合成，采用western blot检测Klotho蛋白表达水平，结果显示，活化形式突变体Rab8Q67L组Klotho蛋白水平明显高于Rab8野生组Rab8WT和失活形式突变体Rab8T22N组。