[发明专利]一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法

说明书

本发明公开了一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，包括Klotho相互作用蛋白的筛选、Rab8与Klotho基因相互结合的验证、Rab8与Klotho相互作用的机制分析这三步骤。本发明首次发现，非小细胞肺癌细胞中Rab8与Klotho存在相互结合，在亚细胞中存在共定位，Rab8通过蛋白合成后途径，与Klotho结合并以囊泡形式促进其向膜表面转运，从而提高膜表面Klotho分布水平。

技术领域

本发明涉及一种蛋白，具体为一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，属于生物学应用领域。

背景技术

肺癌在世界范围内发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位。肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80％以上，5年生存率约为10％，其发病率仍在上升。因此，探索NSCLC的潜在机制，开发更加安全有效的治疗方法具有十分重要的意义。肺癌系老化相关性疾病，确诊肺癌的中位年龄为70岁，75-79岁年龄段是肺癌发病高峰期。随着老化进程，基因组缺陷、表观遗传基因沉默、氧化应激、免疫监视缺陷、端粒异常、慢性炎症，以及组织微环境的改变，都会使肿瘤发生风险明显增加。因此，老化是癌症发生的重要危险因素。此外，抑癌基因的功能缺陷或缺失也是癌症发生的重要因素之一，对于抑癌基因在癌症发生发展中的作用一直是研究癌症发病机制的热点。

本课题组近年来一直致力于抗衰老基因Klotho在肺癌中的作用及相关机制研究，结果发现Klotho除了具有抗正常细胞衰老外，在肺癌中还具有抑癌作用，肺癌组织与正常组织相比，Klotho表达明显下降，其异常表达参与了肺癌的发生发展。

Klotho基因除具有公认的抗衰老作用外，近年研究发现其还在多种肿瘤中发挥抑癌基因作用。Klotho在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌等多种肿瘤中发挥潜在抑癌基因作用。近年来，申请者及团队对Klotho在肺癌中的作用进行了系列研究，结果证实：非小细胞肺癌中，Klotho可通过调节insulin/IGF-1、Bax/Bcl-2、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等信号通路，抑制肺癌细胞生长、迁移，促进其凋亡，改善其对化疗药敏感性。因此，通过对Klotho在肿瘤中作用的多项研究，其抑癌作用显而易见。尽管目前围绕Klotho的抑癌作用已有多项研究，但研究主要集中于其对下游信号的调控，对于Klotho自身的调控，Klotho相互结合蛋白间的相互作用等，认识仍非常局限。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，包括以下步骤：

a、Klotho相互作用蛋白的筛选

利用载体质粒pUltra-Klotho、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2G共转染293T细胞，利用流式细胞仪对病毒滴度进行分析，得到Klotho慢病毒表达载体Lenti-FLAG-Klotho，利用Lenti-FLAG-Klotho感染肺腺癌细胞系A549，以Lenti-FLAG-GFP为对照，对提取的蛋白进行免疫共沉淀实验，筛选与Klotho高概率结合的蛋白，最终挑选出20个蛋白评分超过60分的Rab家族成员，其中Rab8蛋白评分最高；

b、Rab8与Klotho蛋白相互结合的验证，包括外源性和内源性免疫共沉淀实验

外源性免疫共沉淀通过FLAG-Klotho和HA-Rab8共转染HEK293细胞，其中FLAG-Klotho和HA-Rab8是Klotho和Rab8过表达质粒，然后利用标签抗体进行免疫共沉淀实验分析二者的相关性，结果显示Klotho和Rab8二者相互结合；内源性免疫共沉淀通过将A549细胞裂解，进行Rab8/Klotho免疫共沉淀实验，结果显示生理条件下内源性Rab8和Klotho蛋白也存在相互结合；

c、Rab8与Klotho相互作用的机制分析