[发明专利]敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用

摘要

本发明提供敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法敲除了地衣芽孢杆菌DW2的基因组内的负责转录碳代谢转录因子MalR的基因—malR基因，成功得到了缺失malR基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔmalR。相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，本发明所构建得到的菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了23％以上。

主权项

1.敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述的敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法包括以下步骤：(1)以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂；(2)通过重叠延伸PCR将malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；(3)采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；(4)准备质粒T2(2)‑ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒T2(2)‑ori进行双酶切得到线性质粒片段；(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)‑ΔmalR；(6)将敲除质粒T2(2)‑ΔmalR转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；(7)将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到malR基因的上游同源臂或malR基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；(8)挑选malR基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与malR基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了malR基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔmalR；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的malR基因为序列表中NO.1所示。