[发明专利]一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法

摘要

本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，包括以下步骤：(1)摇瓶种子液；(2)种子液的准备；(3)发酵培养；(4)发酵液的萃取提纯；(5)粗提物的纯化：经制备液相色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得西加毒素。本发明使用海洋甲藻共栖细菌株Haliea sp.LZ16‑2为生产菌种，该菌种发酵西加毒素产率较高，可达21.1～25.3μg/L，其发酵时间为60～64小时，节省能耗；方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。

主权项

1.一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株(Haliea sp.)LZ16‑2菌种接种于装液量为200mL的1L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，进行培养，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，进行发酵培养，得到含有西加毒素的发酵液；(4)发酵液的提取：将步骤(3)所得的发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入提取溶剂进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后，加入提取溶剂进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；(5)粗提物的纯化：将步骤(4)所得的粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即得西加毒素。