[发明专利]一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法。本发明是以制备鲎试剂残留的废血浆为原料，通过饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质，冷冻离心得鲎血蓝蛋白，再将血蓝蛋白的PBS溶液通过MW3500Da透析袋透析除盐，经SephacrylS‑100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化、浓缩处理获得高效酚氧化酶活性血蓝蛋白，其反应初速度Vi=74.52 nmol·（min·mg）。本发明获得的产品纯度、活性高，可以用于制备高效，简便，成本低的酚类污染物的微型检测器；本发明制备方法简单，采用MW3500Da透析袋和SephacrylS‑100丙烯葡聚糖凝胶柱相配合的方式可同时达到脱盐、分离、纯化和浓缩的效果。

主权项

1.一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、10000‑12000r/min条件下，离心25‑35min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；（3）取步骤（2）制得的鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液，装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集得血蓝蛋白溶液，4℃保存，备用；（4）将步骤（3）收集的血蓝蛋白溶液过SephacrylS‑100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris‑HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.0‑6.4，操作温度30‑40℃。