[发明专利]基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术

摘要

本发明公开了基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，步骤包括：样品前处理和外泌体标准品的分离；链霉亲和素磁珠的活化及与生物素抗体活化；免疫磁珠与外泌体结合；外泌体核酸样品制备；电化学发光检测目的核酸序列；本发明的优点有：能对尿液、血清、唾液、细胞培养液等生物样品中的外泌体进行分离和分析；采用生物素与链霉亲和素特异性结合将抗体修饰到磁珠表面，体系稳定，避免了非特异性的干扰；体系可控，通过改变抗体类型分离纯化不同亚型的外泌体，可用于核酸表达谱研究和外泌体分型研究；终浓度可控，磁富集后再稀释或再释放获得所需浓度，便于后续检测；分离速度快，对仪器要求简单，可以同时处理多个样品。

主权项

1.基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；步骤二：外泌体标准品的分离1)样品的前处理；2)超速离心分离外泌体标准品；步骤三：免疫磁珠的合成：(1)把链霉亲和素磁珠进行活化：1)制备反应液Ⅰ分装备用；2)将链霉亲和素磁珠母液混匀后，磁分离去除保护试剂，往EP管加入PBS混匀；3)将EP管置于磁分离架，静置，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；4)重复一次步骤2‑3，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。(2)链霉亲和素磁珠与抗体结合：1)制备反应液Ⅱ；2)将反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠混合物、10ul生物素标记的抗体混合，将混合液置于恒温摇床反应；3)将混合液置于磁分离架，静置；4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用；步骤四：免疫磁珠与外泌体结合即捕获与富集外泌体：1)将样品与免疫磁珠混合；2)孵育：室温摇床放置10‑30min；3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置，去除液体保留磁珠；4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤2‑3次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落；5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物；步骤五：外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法：A.外泌体DNA的分离1)在制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extractionbuffer 500μl以裂解外泌体，混匀于37℃水溶1h；2)置于磁分离架，液体转移到EP管A，去除磁珠；3)每管加入蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层；4)每管加入饱和酚，缓慢摇晃，离心；5)取上清，每管加入饱和酚和氯仿－异戊醇，摇匀，离心；6)取上清，每管加入氯仿－异戊醇，摇匀，离心；7)取上清，每管加NaAC，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入‑20℃保存2h以上；8)离心，去上清，加入70％乙醇，离心5min，去上清，干燥；9)加入灭菌去离子水，转弹，混匀；B.外泌体总RNA的分离1)将磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊；2)置于磁分离架静置，将上清转移到EP管B1；3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置；4)4℃离心，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白；5)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置；6)4℃离心，白色胶状沉淀为RNA；7)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀；8)离心，弃上清，室温干燥，DEPC水重悬；C.总核酸的分离往磁珠外泌体复合物加入细胞裂解液，振荡混匀，离心取上清；步骤六：电化学发光检测目的核酸序列：(1)三联吡啶钌的合成：1)电子天平称取：二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，NaHCO3,2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy，于50ml圆底烧瓶中；2)加入甲醇，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h；3)所得溶液在冰浴中冷却2h；4)同时将pH值调到4.4；5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀；6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6溶液，搅拌后置于低温环境中挥发滤液，观察晶体产生；期间可反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；(2)三联吡啶钌的活化：1)电子天平称取：二环乙基碳二亚胺，N－羟基琥珀酰亚胺；2)搅拌条件下溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后冰浴冷却；3)加入上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀；4)室温下密封振荡，静置；5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体；(3)DNA探针标记三联吡啶钌：该反应体系中，活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性；用锡箔纸避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；并用纯水低温保存；(4)聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物的制备：1)取聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底；2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，立即盖上管盖；3)上下振荡以充分混匀，离心收集；4)加入DNA探针标记的三联吡啶钌；5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育；6)用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；7)离心；8)倒去橙色上清液，加入预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；9)离心；10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；11)离心，12000rpm，4℃，20min；12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；13)离心，得到聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针；14)加水稀释，放入冰箱保存；(5)磁捕捉检测目标DNA序列：构建一种以聚赖氨酸‑三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法:1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中；2)构建磁捕捉核酸检测体系：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至目标体积；3)信号检测：将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。