[发明专利]一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，具体步骤如下:获取紫苏无菌苗；取无菌苗外植体诱导质地优良的愈伤组织；以紫苏愈伤组织为原材料，采用Box‑Behnken中心组合设计和响应面法对液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳条件进行优化；紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证。发明方法的迷迭香酸产量提高近10倍，同时更快速地获取高产迷迭香酸的愈伤组织，节约成本、节约室内培养空间、可以周年生产、培养效益明显增加，不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考；具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。

主权项

1.一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)紫苏无菌苗的获得将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；(2)愈伤组织的诱导在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3‑4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比采用Box‑Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用Design Expert 8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL 60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培养物中迷迭香酸含量；(6)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证使用Design Expert 8.0软件确定紫苏细胞悬浮培养的最佳方案，再根据上述条件做验证实验，以充分验证所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。