[发明专利]一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，具体步骤如下:获取紫苏无菌苗；取无菌苗外植体诱导质地优良的愈伤组织；以紫苏愈伤组织为原材料，采用Box‑Behnken中心组合设计和响应面法对液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳条件进行优化；紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证。发明方法的迷迭香酸产量提高近10倍，同时更快速地获取高产迷迭香酸的愈伤组织，节约成本、节约室内培养空间、可以周年生产、培养效益明显增加，不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考；具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。

技术领域

本发明属于植物细胞培养生产次生代谢产物的技术领域，具体为一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法。

背景技术

紫苏(Perilla frutescens(L.)Britt.)，别名荏、白苏、赤苏等，为唇形科一年生草本植物，原产于中国，主要分布于中国、印度、日本、韩国等国家，是我国卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药材之一。紫苏叶中含有多种具有生理活性的天然化学成分，如花青素、木犀草素、芹菜素、儿茶素、迷迭香酸(Rosmarinic Acid,RosA)等，其中迷迭香酸含量较高。迷迭香酸是一种天然的水溶性抗氧化剂，具有多种生物活性，具有明显的抗炎、抗氧化、免疫抑制等作用，广泛应用于食品、医药和化妆品领。因此迷迭香酸的生产越来越受到人们的广泛关注，如何有效提高植物中迷迭香酸的含量也成为当今研究的热门话题之一。

植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化，具有细胞分散性好，形状及大小一致、生产迅速、易于控制等优势，已被广泛应用于生理生化、分子生物学等基础研究以及育种、次生代谢物生产等领域。自从1956年，Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来，据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。紫苏细胞悬浮培养生产次生代谢物质如花青素、三萜类化合物等已有报道，但关于细胞悬浮培养生产迷迭香酸研究报道少且产量较低。本研究旨在通过响应面法优化紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸的条件，为紫苏细胞大规模培养次生代谢产物提供理论依据和技术参考。

发明内容

本发明为解决天然的植物次生代谢产物迷迭香酸产量较低，而化学合成迷迭香酸非绿色，成本高的问题，提供了一种紫苏细胞悬浮生产高产迷迭香酸的方法，本方法不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，包括如下步骤：

(1)紫苏无菌苗的获得

将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl₂，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；

(2)愈伤组织的诱导

在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；

(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；

将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；

(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比