[发明专利]基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法

摘要

本发明公开了一种基于核酸适配体‑量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，包括Cry1Ab蛋白即Bt蛋白的、核酸适配体‑量子点混合物的制备，将核酸适配体‑量子点与芽孢杆菌孢子结合。本发明通过核酸适配体‑量子点与芽孢杆菌孢子结合的方法对转基因水稻中Bt蛋白结果进行检测，检测结果客观、易判定，可对转基因产品的含量进行定量分析，同时检测速度快，检测灵敏度高。

主权项

1.一种基于核酸适配体‑量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，其特征在于，包括以下步骤：(1)核酸适配体‑量子点的制备：1.1、将13.9μL 10mM SMCC(琥珀酰亚胺‑4‑(N‑马来酰亚胺)环已烷‑1‑1羟酸酯)添加到125μL量子点中并在室温下放置一小时以激活量子点；1.2、在300μL 1mg/ml一倍工作浓度的PBS溶液中制备5′巯基修饰的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl 1m的二硫苏糖醇(DTT)并在室温下放置30分钟以缩减适配体；1.3、激活量子点的溶液以及缩减适配体的溶液分别通过一个nap‑5脱盐柱(Sephadex G‑25脱盐柱)，每个溶液收集500μl；1.4、然后将量子点和缩减适体在室温下反应一个小时。将10.1μLβ‑巯基乙醇(100μM的最终浓度)加入到混合物中来淬火共轭反应，并在室温下放置30分钟，通过柱纯化，共收集到250μL核酸适配体‑量子点；1.5、将10μl核酸适配体‑量子点溶解在1ml反渗透纯净水中。运用一个uv‑2100分光光度计来衡量在260nm时的吸光度；1.6、核酸适配体‑量子点的实际浓度由与最初的核酸适配体浓度(1.08mg/ml)进行比较来决定；(2)将核酸适配体‑量子点与芽孢杆菌孢子结合：2.1、将30μL核酸适配体‑量子点放置在一个试管中并用600μL PBS进行稀释；2.2、用同样的程序进行一系列重复的反应：核酸适配体‑量子点无孢子，非结合的量子点与Bt孢子，核酸适配体‑量子点与纯化的Bt孢子结合，核酸适配体‑量子点与BG孢子结合；2.3、之前收集的孢子，用PBS将13mm微孔膜过滤器(PVDF，亲水性，0.45μm)洗两次，孢子暴露于核酸适配体‑量子点或非结合的量子点中的任何一个后在过滤器中收集并用1ml一倍工作浓度的PBS溶液洗涤三次，洗过的孢子在1ml PBS中收集。