[发明专利]一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法

摘要

本发明公开了一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法，采用如下步骤：粪样采集、滤除粪渣、一次沉淀、虫卵漂浮、二次沉淀、三次沉淀、虫卵孵化、幼虫收集。本发明提供一种高效的动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法。它避免了霉菌污染整个孵化过程，减少了木炭末和蔗糖等的去除程序和杂质困扰，简化了操作步骤，粪渣去除率高，缩短了孵化时间，可直接监测孵化过程，避免了检测回收和样本浪费，24孔单独孵化可提供科学试验方便，适于推广应用。

主权项

1.一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法，其特征在于，采用如下步骤：1、粪样采集：选取4个月以上未驱虫的目标动物，通过直肠无菌采集新鲜粪便，装入无菌样本袋内；将采集到的粪便于2‑8 ℃运输并保存，72 h内进行粪便虫卵收集处理；2、滤除粪渣：称取20 g粪便样本放入洁净三角瓶中，用玻璃棒将粪便捣碎，加入10倍重量的灭菌蒸馏水，放入玻璃珠，反复旋摇三角瓶，使粪便充分破碎并释放虫卵；用40目筛滤除粪渣，再用灭菌蒸馏水将虫卵从粪渣充分洗入滤液中，收集滤液；3、一次沉淀：将收集的滤液分装于50 ml离心管中，1500 r/min 离心4 min或静置20 h，使虫卵沉淀到离心管底部，弃上清；4、虫卵漂浮：在沉淀中加入饱和食盐水至50ml刻度，漩涡震荡15 s，静置10 min，1000 r/min 离心4 min，静置5 min，立即用1000 μl移液器，与液面呈45°角，枪头口一半露出于液面上，带气吸取液面表层漂浮物；每50 ml吸取5 ml，分别转移入各个新离心管内；5、二次沉淀：于各个新离心管中加入40 ml灭菌蒸馏水，1000 r/min 离心4 min，使大部分虫卵沉淀到离心管底部，用移液器从上至下慢慢地吸取25 ml上层液体弃掉，吸取时使枪头刚刚浸入液面下即可；6、三次沉淀：加入25 ml灭菌蒸馏水，1500 r/min 离心4 min，使虫卵沉淀到离心管底部，弃上清；7、虫卵孵化：按照体积比灭菌蒸馏水和Earle’s液1:1的比例配制平衡液，根据实际需要调整虫卵浓度，于各个新离心管中加入5‑10 ml平衡液，混匀并分装于24孔板内，于28‑32 ℃，相对湿度70‑80%下孵化；8、幼虫收集：恒温安静孵化48 h后，在倒置显微镜下观察虫卵孵化情况，每隔12 h观察一次，孵化出的大多数幼虫沉淀在24孔板底部，根据需要，能直接收集各期幼虫。