[发明专利]一种水稻遗传转化方法

摘要

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：愈伤诱导、制备侵染液、侵染、共培养、脱菌‑筛选、分化、生根培养，得到水稻的带有Kan抗性基因的水稻遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的水稻转基因植株。

主权项

1.一种水稻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)愈伤诱导水稻种子的灭菌：用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3‑5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，31℃培养室中16h光照/8h黑暗培养8‑10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染；2)制备侵染液取50ml Os‑inf，加入100μl AS，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；3)侵染将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os‑cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；5)脱菌‑筛选脱菌：200ml无菌水加cef 400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1‑2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90min；第4‑5次，轻摇清洗后弃去废液，最后，用无菌滤纸吸干愈伤；筛选：将吸干的愈伤，接至Os‑Hn筛选培养基，每隔10天继代1次，继代至第3‑4次时，外植体周围出现新生长的金黄色愈伤，为筛选成功的愈伤；6)分化将筛选出的阳性愈伤接至Os2‑Hn分化培养基，每隔10‑15d进行一次继代，继代3‑4次，期间：分化开始15d，愈伤开始出现绿色；最终分化成功的愈伤再经25‑30d成3‑5cm幼苗；7)生根将长至3‑5cm的阳性幼苗清理好基部愈伤，接种至Os3培养基8‑12天，至长出1‑2条新生根；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：