[发明专利]一种水稻遗传转化方法

说明书

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：愈伤诱导、制备侵染液、侵染、共培养、脱菌‑筛选、分化、生根培养，得到水稻的带有Kan抗性基因的水稻遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的水稻转基因植株。

技术领域

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种水稻遗传转化方法。

背景技术

水稻是世界上分布最广、最为重要的粮食作物之一，其遗传转化一直受到大家的重视。传统水稻的品种改良方法一般是通过品种杂交、远缘杂交等，其转基因技术起源于1988年，到目前为止，其遗传转化体系已经发展的较为完善。但是，仍然存在着转化时间长、转化效率低等问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了水稻遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。

本发明是这样实现的，一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：

1)愈伤诱导

水稻种子的灭菌：用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；

愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，31℃培养室中16h光照/8h黑暗培养8-10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染；

2)制备侵染液

取50ml Os-inf，加入100μl AS，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；

4)共培养

将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os-cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；

5)脱菌-筛选

脱菌：200ml无菌水加cef 400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1-2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90min；第4-5次，轻摇清洗后弃去废液，最后，用无菌滤纸吸干愈伤；

筛选：将吸干的愈伤，接至Os-Hn筛选培养基，每隔10天继代1次，继代至第3-4次时，外植体周围出现新生长的金黄色愈伤，为筛选成功的愈伤；

6)分化

将筛选出的阳性愈伤接至Os2-Hn分化培养基，每隔10-15d进行一次继代，继代3-4次，期间：分化开始15d，愈伤开始出现绿色；最终分化成功的愈伤再经25-30d成3-5cm幼苗；

7)生根

将长至3-5cm的阳性幼苗清理好基部愈伤，接种至Os3培养基8-12天，至长出1-2条新生根；

各步骤中用到的培养基具体配方见下表：

上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：

进一步地，所述愈伤诱导过程中，Os1培养基上每皿接种18粒种子。

进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD₆₀₀＝1.0。