[发明专利]青藤碱对胰腺癌细胞系SW1990增殖凋亡的检测方法

摘要

本发明属于含有机有效成分的医药配制品技术领域，公开了一种青藤碱对胰腺癌细胞系SW1990增殖凋亡的检测方法，通过各种体外实验探讨青藤碱对胰腺癌细胞增殖凋亡的改变；CCK‑8方法检测不同浓度梯度，不同作用时间下青藤碱对胰腺癌细胞存活的影响；平板克隆实验检测青藤碱对细胞集落形成的影响；流式细胞术及免疫印迹实验检测青藤碱对细胞凋亡的影响。细胞增殖率随着青藤碱剂量增加而降低，细胞集落形成数量逐渐减少，细胞凋亡率逐渐增加；western blot结果显示PARP蛋白表达水平逐渐增多。青藤碱在一定程度能够有效的抑制胰腺癌的增殖，并且能够有效诱导细胞凋亡的发生，表明青藤碱可能在胰腺癌的治疗中具有重要作用。

主权项

1.一种青藤碱对胰腺癌细胞系SW1990增殖凋亡的检测方法，其特征在于，所述青藤碱对胰腺癌细胞系SW1990增殖凋亡的检测方法包括以下步骤：步骤一，SIN首先用DMSO溶解，配置储存液，浓度为100mmol/L，再用无血清DMEM将储存液稀释成10mmol/L的工作液；步骤二，胰酶消化胰腺癌SW1990细胞，中和制备细胞悬液，计数，稀释成1×105个/ml，96孔板内每孔种植细胞3000个，每组5个复孔，实验组设置5个SIN浓度梯度，对照组不做处理；种植胰腺癌细胞SW1990于三个96孔板，分别于三个时间点即24h、48h、72h检测96孔板的吸光度；检测时弃去孔内培养基，每孔加入CCK‑8 10ul和无血清DMEM 100ul的混合液，细胞培养箱中孵育2h，酶标仪下检测波长450nm处的吸光度；步骤三，平板克隆细胞集落形成实验胰酶消化胰腺癌细胞SW1990，制备细胞悬液，细胞计数1×104个/mL，将1000个细胞种植于6cm培养皿中，无菌细胞培养箱培养6‑10h后给药；实验分组同上，高糖DMEM培养基和加入的药物量达到5mL，培养10～14d，4％多聚甲醛固定20‑30min，1％结晶紫染色20‑30min，PBS清洗数遍，烘箱烘干处理，拍照；步骤四，胰酶消化制备SW1990细胞悬液，细胞计数1×105个/ml，接种细胞于6孔板内，每孔种植5×104个细胞，使细胞均匀分布于6孔板内，培养24‑30h，加药处理，实验分组同上，继续培养24h，收集各孔内上清液体于流式管，PBS清洗1遍，收集，加1ml0.05％不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，收集于流式管，800rpm，5min，弃去上清，3ml PBS清洗干粉，800rpm，5min，弃上清，每组加入150ul 1×Binding Buffer,悬浮细胞约达到1×105个，在细胞悬液中加入2.5ul Annexin V‑FITC、5ul PI，混匀；4℃避光反应15min；流式细胞仪上机检测，记录结果；步骤五，将制备好的细胞悬液均匀的种植于6cm培养皿内，细胞量达到1×105个，实验分组以及处理同上；给药24h后，收集上清和细胞，制成细胞干粉，按照干粉的量每孔加入相应的裂解液100‑200ul，超声充分裂解提取蛋白，采用BCA试剂盒制备标准蛋白曲线，对各组样品进行定量，计算蛋白浓度，按照50ug上样量计算得出上样体积，依次经过电泳、转膜、洗膜、一抗4℃摇床孵育12‑16h、二抗室温孵育2h、洗膜、化学发光试剂盒ECL配置，于凝胶成像系统下曝光，以GAPDH为内参照；步骤六，应用SPSS 22.0软件对数据进行分析，组间比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。