[发明专利]检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法

摘要

本发明名称为检测血液样品中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法，它利用液相色谱分析仪和紫外检测器对标准溶液进行标定，分别拟合得出代表奥卡西平浓度的标准曲线方程为y1＝a*x1+b和代表奥卡西平代谢物浓度的标准曲线方程y2＝c*x2+d，取待测血液样品，对该待检测血液样品经过前处理后，使用相同的液相色谱分析仪和紫外检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y1和y2值，将待测血液样品的y1和y2分别代入上述两个标准曲线方程中，通过计算分别得到待测血液样品中奥卡西平及其代谢产物的相对浓度x1和x2，内标物工作液浓度是已知的，通过计算可以得到待检测血液样品中的奥卡西平及其代谢产物的浓度。

主权项

1.一种检测血液样品中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和90μL空白血清或血浆分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀1‑2min后，加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀4‑6min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心8‑12min，得到上清液，对上述标准溶液分别移取800μL上清液并置于另一个离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；向上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液，进行溶解，然后在1500‑2000rpm转速下涡旋混匀1‑2min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心4‑6min，得到上清液，分别移取上述上清液，利用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测，得到至少三种不同浓度的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图，从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图中分别得到奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的峰面积，分别以上述至少三个不同浓度的奥卡西平标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述奥卡西平标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b；以上述至少三种不同浓度的奥卡西平代谢产物的标准溶液峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2：以上述奥卡西平代谢产物的标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝c*x2+d，并且得出权重系数c、d；上文所述的标准工作液为含有奥卡西平和奥卡西平代谢产物的溶液，内标工作液为含有2‑萘酚的溶液；(a)标准储备液的配制：精确称取奥卡西平标准品10mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液A，并在‑80℃条件下保存，有效期为1个月；精确称取奥卡西平代谢产物标准品10mg置于5mL容量瓶，用50％甲醇溶液进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液B，并在‑80℃条件下保存，有效期为1个月；(b)标准工作液的配制取适量步骤(a)中标准储备液A与标准储备液B混合，用50‑80％的甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中奥卡西平浓度为270μg/mL、奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL，然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释，分别对浓度范围在20‑270μg/mL的奥卡西平和浓度范围在40‑540μg/mL奥卡西平代谢产物进行配制，得到不同浓度的标准工作液，并在‑80℃条件下保存，有效期为1个月；(c)内标工作液的配制：精确称取2‑萘酚标准品5mg于5mL容量瓶，用甲醇溶解，并定容至5mL，得到标准储备液C，该内标工作液‑80℃条件下保存，有效期为1个月。(二)检测血液的离心取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(d)用移液枪移取10μL步骤(c)的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，并在1200‑2000rpm的转速下涡旋混合1‑2min后，向上述离心管中加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚，并在1200‑2000rpm的转速下涡旋混合4‑6min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心8‑12min，得到上清液；(e)取步骤(d)上清液800μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液，然后在1200‑2000rpm转速下涡旋混匀1‑2min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心4‑6min，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测样品的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的色谱图，从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标色谱图中可以得到奥卡西平峰面积、奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积，将奥卡西平峰面积与内标物峰面积的比值y1代入上述步骤(一)的标准曲线方程y1＝a*x1+b中，通过计算得到待检测样品中奥卡西平与内标物的相对浓度x1，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平的血药浓度；将奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积的比值y2代入上述步骤(一)的标准曲线方程y2＝c*x2+d中，通过计算得到待检测样品中奥卡西平代谢产物与内标物的相对浓度x2，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平代谢产物的血药浓度。