[发明专利]一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系

摘要

本发明涉及一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其工艺步骤包括：通过体细胞胚发生技术体系诱导胚性愈伤组织；抗生素潮霉素和硫酸卡那霉素适宜浓度的筛选；农杆菌侵染液的制备；侵染和共培养；抗性愈伤组织的筛选和继代培养；抗性体细胞胚的萌发与成苗；转基因植株的GUS组织学染色和PCR检测。本发明以百合的胚性愈伤组织为受体材料，首次在遗传转化后诱导产生体细胞胚进而直接发育形成完整植株，转化效率比其他种类百合现有的报道显著提高，可达29.17%。其优势在于受体细胞基数大，转化后诱导的体细胞胚是单细胞起源，很好地避免嵌合体的产生，且转化后代外源基因遗传稳定性高，变异率低。

主权项

1.一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其特征在于：包括以下步骤：（1）获得胚性愈伤组织选取小鳞茎直径为1‑1.2 cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5 cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1 Picloram （毒莠定）+ 0.2 mg·L‑1 NAA （萘乙酸）] 中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15 d，作为转化的受体材料；（2）抗生素敏感性测定通过在体细胞胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram（毒莠定）+ 0.2 mg·L‑1 NAA（萘乙酸）] 中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100 mg·L‑1和30 mg·L‑1；（3）优化遗传转化条件比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h；（4）制备农杆菌侵染液将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5 mL新鲜YEB液体培养基中200 rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50 ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；用50 mL含有100 μM 乙酰丁香酮 (AS) 的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200 rpm振荡培养2 h，作为农杆菌侵染液备用；（5）侵染和共培养在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10 min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基[MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) +100 μM AS (乙酰丁香酮) ]中，25±1℃进行持续黑暗培养48 h；（6）抗性愈伤组织的筛选与继代培养将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) + 400 mg·L‑1 cef (头孢霉素)+ 30 mg·L‑1 Hyg (潮霉素) ]，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2周后将完全脱菌的愈伤组织转接至抗性愈伤筛选培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) + 30 mg·L‑1 Hyg(潮霉素) ] 中继续培养，此后每2周转接一次，培养4周抗性愈伤组织上会新生出体细胞胚；（7）体细胞胚萌发和成苗筛选培养结束后，切除愈伤基部坏死的组织，将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基 [MS + 0.5 mg·L‑16‑BA(6‑苄氨基腺嘌呤)] 上，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1；培养4周可形成具有子叶和根的成熟体细胞胚，将成熟体细胞胚转接至MS基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株；（8）转化植株的转基因鉴定a. GUS组织学染色：对转化植株的叶片、鳞片、根分别进行常规GUS组织染色，以未转化的野生型植株作为对照，如果成功染色说明携带标记基因的载体成功整合到植株基因组中；b. PCR检测：对成功染色的植株提取基因组DNA，针对载体T‑DNA区域内的DNA序列设计特异引物，以细叶百合基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型植株作对照，若转化植株的PCR结果为阳性，则表明外源基因整合到了植株的基因组中。