[发明专利]一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系

说明书

本发明涉及一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其工艺步骤包括：通过体细胞胚发生技术体系诱导胚性愈伤组织；抗生素潮霉素和硫酸卡那霉素适宜浓度的筛选；农杆菌侵染液的制备；侵染和共培养；抗性愈伤组织的筛选和继代培养；抗性体细胞胚的萌发与成苗；转基因植株的GUS组织学染色和PCR检测。本发明以百合的胚性愈伤组织为受体材料，首次在遗传转化后诱导产生体细胞胚进而直接发育形成完整植株，转化效率比其他种类百合现有的报道显著提高，可达29.17%。其优势在于受体细胞基数大，转化后诱导的体细胞胚是单细胞起源，很好地避免嵌合体的产生，且转化后代外源基因遗传稳定性高，变异率低。

技术领域

本发明属于球根花卉生物技术领域，具体涉及百合稳定遗传转化体系的建立，即以诱导出的胚性愈伤组织为受体，基于农杆菌介导法针对细叶百合建立一种稳定高效的遗传转化体系。

背景技术

植物遗传转化 (plant genetic transformation)，是一种独特的DNA跨界转移技术，是有针对性的将外源基因导入植物基因组中，让其在后代植株中遗传和稳定表达的植物遗传改良技术。这项技术是植物基因工程的核心，转基因技术的建立和发展，使人们能够根据需求将特定的基因导入不同植物之间进行表达，为植物遗传改良提供了新途径。百合(Lilium) 是重要的球根花卉, 花色丰富，株型优美，观赏价值高、市场需求量大、经济价值可观。我国具有丰富的野生百合资源，但目前国内生产中应用的百合种球大多依赖进口，我国具有自主知识产权的品种极少，种球生产技术体系亦不成熟，生产成本居高不下。伴随生物技术的快速发展, 建立稳定高效的遗传转化体系对百合种质资源保存、种球繁育以及通过基因工程技术进行遗传性状改良具有重要意义。

在百合遗传转化研究中，利用基因枪法已成功获得了一些转基因百合，但基因枪法转化效率低、形成的嵌合体多，且筛选量工作量大、成本高，转化效率较低。目前应用最广的转基因方法是农杆菌介导法，具有转化成本低，转化效率高的优点，但农杆菌介导法成功应用于百合遗传转化的案例尚少，这可能是由于百合对农杆菌的侵染不敏感、且基因型差异较大的缘故。Cohen (1992) 首次用农杆菌介导法转化百合 'Nellie White' 鳞片，在鳞片上观察到瘤状突起，并且在诱导产生的愈伤组织里检测出冠瘿碱基因的表达。Hoshi(2004) 等以东方百合花丝诱导产生的愈伤组织为受体，获得了6株携带目的基因的转化苗，转化效率为3%。Wang Yue (2012) 等以农杆菌菌株AGL0对20个百合品种花丝及花梗诱导产生的愈伤组织进行侵染，GUS瞬时表达率从0.3%-20.6%，但是稳定表达率仅为1.4%。Yinyan Qi (2014) 等分别以OT百合‘罗宾娜’（Liliumtenuifolium oriental×trumpet）的悬浮细胞团作为转化受体材料进行了农杆菌介导的遗传转化，从132株抗性植株中检测获得4个转基因株系。由此可见，关于农杆菌介导百合遗传转化的研究尚少，且转化效率低、遗传稳定性差、转化后受体材料再生困难，仍然无法适用于百合生产和分子育种的需求。利用体细胞胚发生建立百合遗传转化体系的研究尚未见报道。

细叶百合 (Lilium pumilum DC. Fisch.)，别名山丹，是我国原产的珍稀野生百合。细叶百合抗性较强，耐旱、耐寒、耐盐碱，引种无须驯化，加之花色艳丽、花型优美，可直接应用于家庭盆栽、庭院及城市园林绿化。然而，细叶百合植株茎秆细弱、花朵娇小、颜色单一，观赏性状有待于进一步改良。高效遗传转化体系的建立对于种质资源保存、基因工程育种以及百合发育、繁殖等领域的基因功能验证具有重要意义。当前对细叶百合的研究大多集中在分类学、生物学、无性繁殖技术等方面，陈丽静等 (2013) 曾以鳞片为外植体初步探讨了细叶百合的组织培养技术，关于细叶百合的遗传转化尚未见报道。因此，建立稳定、高效的细叶百合遗传转化体系迫在眉睫。