[发明专利]一种小麦单倍体育种所得纯合系后代的流式鉴定方法

摘要

本发明公开一种小麦单倍体育种所得纯合系后代的流式鉴定方法，属于生物技术领域。本方法通过将缓冲液母液中柠檬酸、氯化钠的浓度优化为400～440g/L、160～200g/L，采用壬基酚聚氧乙烯醚代替常见的稳定剂和分散剂，采用浓度为100～300mg/L的Hoechst33258替代DAPI和PI作为荧光染料，并将过滤采用的滤网目数和离心的转速分别优化为350～450目和1000～3000r/min。与现有技术相比，本发明的方法缩短了鉴定时间，简化了鉴定步骤，缓冲液配置更合理，能获得更多有效细胞，去除更多细胞碎片，避免了检测干扰，提高了鉴定精度。

主权项

1.一种小麦单倍体育种所得纯合系后代的流式鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取一定量柠檬酸、氯化钠加入到双蒸水中混匀，使柠檬酸、氯化钠的浓度分别为400～440g/L、160～200g/L，得缓冲液母液备用；S2、将双蒸水和所述缓冲液母液按体积比19:1混匀，得缓冲液备用；S3、每100ml所述缓冲液加入0.01～0.1ml的壬基酚聚氧乙烯醚和0.01～0.09ml的β‑巯基乙醇,混匀得缓冲工作液备用；S4、取一定量Hoechst 33258加入到所述缓冲液中溶解混匀，使Hoechst 33258的浓度为100～300mg/L，得染色母液备用；S5、将所述染色母液和所述缓冲液按体积比1～2：500混匀，得染色工作液；S6、取待鉴定的新鲜小麦愈伤组织样品，去除表面培养基成分后置于培养皿中；加入所述缓冲工作液，确保组织样品浸泡在缓冲工作液中，以锋利刀片将组织样品切碎；再加入所述缓冲工作液定容，轻微振荡，放置10～30分钟；S7、将步骤S6所得溶液以350～450目滤网过滤，所得滤液以1000～3000r/min的转速离心5～15分钟，弃上清，加入所述染色工作液至暗处染色10～30分钟备用；S8、将步骤S7的暗处染色的溶液上样，以面积参数HOECHST‑A对高度参数HOECHST‑H作散点图排除粘连体后，以HOECHST‑A做直峰图，将用作比对的标准小麦二倍体的G0/G1峰维持在350处，对比待鉴定小麦组织样品的峰的位置鉴定其倍数。