[发明专利]一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法

摘要

本发明公开了一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，该方法包括花药愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽生根培养、组培苗壮苗培养基、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率等步骤，在进行组织培养过程中采用特定的培养基，特定的培养基为在常规培养基配方上利用以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来的培养基，培养完成后采用利用分子标记技术进行脱毒鉴定。本发明显著提高脱毒率，操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

主权项

1.一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.花药愈伤组织诱导培养选取花蕾为外植体，在4℃条件下处理4天；流水冲洗，再进行消毒后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中；其中愈伤组织诱导培养基：三十烷醇0～3mg·L‑1、2,4‑D 0.2～0.8mg·L‑1、6‑BA 0.3～0.7mg·L‑1、海藻糖30g·L‑1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L‑1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；b.愈伤组织分化培养将步骤a中培育的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽；其中愈伤组织分化培养基：三十烷醇1～3mg·L‑1、6‑BA 0.3～0.7mg·L‑1、海藻糖30g·L‑1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L‑1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；c.丛生芽生根培养将步骤b中高1.8～2.2cm的丛生芽转入生根培养基；其中生根培养基：IBA 0.2～1mg·L‑1、海藻糖30g·L‑1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L‑1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；d.组培苗壮苗培养基将步骤c中完整组培苗植株转入壮苗培养基；其中壮苗培养基：IBA 0.1～0.5mg·L‑1、IAA 0.5～1.5mg·L‑1、海藻糖30g·L‑1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L‑1，其余成分与1/2MS培养基一致，pH值为5.8；e.炼苗、染色体加倍和移栽逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗；然后用秋水仙素浸泡根系进行染色体加倍，移栽到温室；f.倍性鉴定将步骤e中得到苗培养20天后，进行倍性鉴定获得纯合二倍体植株；g.利用分子标记检测病毒的脱毒率提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：CMV上游引物：5＇‑TAATTACAGGCCCTTACCCGC‑3＇CMV下游引物：5＇‑TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC‑3＇WMV上游引物：5＇‑CATTGAAAATGGAGTGACACTG‑3＇WMV下游引物：5＇‑GCCAAAACCTGCATCGCAC‑3＇CGMMV上游引物：5＇‑CGATGGCTTACAATCCGATCACAC‑3＇CGMMV下游引物：5＇‑CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC‑3＇。