[发明专利]一种甲烷单细胞蛋白的生产方法

摘要

本发明涉及一种利用甲烷生产单细胞蛋白的工业化生产方法，为有效解决我国畜禽、水产动物饲料蛋白短缺，解决养殖业生产成本上涨等问题提供一条新方法。本发明利用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中的一种或者多种菌株利用甲烷生产单细胞蛋白，所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达70%以上，发酵用菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。

主权项

1.一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、使用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中任意一种或任意两种以上混合物；将甘油管保藏的菌种0.5mL 接种至无机盐试管斜面培养基上，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4 d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl、1.0g（NH4）2SO4和20g 琼脂，pH 自然；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%‑5% 的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4‑6 d，菌体OD600 达到9 ～10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%‑3.0% v/v；所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1‑1:5，每24h‑48h 换气一次；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L 罐中配制30L 的无机盐液体培养基，加入2.5％v/v的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min 即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25‑35℃时，开始接种；B、摇瓶种子1000mL 从50L 发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20‑30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5‑7d 后，得一级种子；3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3 发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：5m3 发酵罐中装含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3 ；所述的无机盐液体培养基为：1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；用2）A 步骤中的灭菌方法对含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L 接种到3m3的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01‑0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05‑0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20‑30℃，1 ：1‑1.5vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6‑8d，得二级种子；4）、发酵罐甲醇蛋白生产发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3‑4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121‑125℃，进入在层流罐中维持20min 后，进入50m3 发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3 发酵罐温度维持在121℃ 30min，此时，用蒸汽对与50m3 发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3 发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3 发酵罐内的发酵培养基降温到30℃‑35℃ ；然后将二级种子以发酵培养基体积10% 的接种量接种到50m3 发酵罐内开始发酵，发酵温度20‑30℃，1 ：1.5‑2 vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0.04MPa，pH自然，培养7‑9d得发酵液；5）、出料发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4‑8 小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5 的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉，包装。