[发明专利]高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法

摘要

一种高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，系以十二种试剂参与基因芯片反应流程，至少包括RNA萃取、生物素标定、杂合反应、以及讯号侦测步骤。本发明不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到相对应的功效。其中生物素标定试剂配方的创新处，在于包含反转录反应的试剂，因此无须分开两个步骤进行。而该重复反应乃指重复进行反转录级生物素标定，可加强杂合反应后的讯号。藉此，透过本发明提出的高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，可于临床检验检查时，不需进行放大，透过基因芯片就可以检测检体中所的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。

主权项

1.一种高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，系以十二种试剂参与基因芯片反应流程，其特征在于至少包括下列步骤：RNA萃取步骤：于一基因芯片感测单元的待测检体纯化与标定区中，利用一基因芯片反应试剂单元中RNA萃取组件所包含蛋白酶试剂、RNA专用裂解试剂、磁珠保存/结合试剂、RNA清洗试剂及RNA回溶/保存试剂，对一待测检体进行RNA萃取反应，将该待测检体与由蛋白酶K及保存液所组成的蛋白酶试剂及由脱氧核酸酶、裂解配方及RNA保护配方所组成的RNA专用裂解试剂均匀地混合反应后，加入由磁珠、核酸结合配方及RNA保护配方所组成的磁珠保存/结合试剂均匀地混合反应后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，加入由清洁剂及RNA保护配方所组成的RNA清洗试剂混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除反应溶液，并加入作为RNA回溶/保存试剂的RNA保存液均匀地混合反应后，以磁铁固定磁珠，收集所得的mRNA溶液；生物素标定步骤：利用该基因芯片反应试剂单元中生物素标定组件所包含生物素标定试剂及生物素免疫结合试剂，对上述mRNA溶液进行生物素标定，将该mRNA溶液加入由生物素标定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗冻剂所组成的生物素标定试剂均匀地混合反应后，再加入由生物素免疫抗体、磷酸酶、及抗冻剂所组成的生物素免疫结合试剂均匀地混合反应后，取得以生物素标定的探针；杂合反应步骤：将一基因芯片置入该基因芯片感测单元的基因芯片反应与显像区中，利用该基因芯片反应试剂单元中杂合反应组件所包含杂合反应试剂，偕同上述探针对该基因芯片进行杂合反应，将该基因芯片加入由杂合反应配方、背景抑制配方、清洁剂、及无机盐类所组成的杂合反应试剂均匀地混合反应后，再加入该探针反应3～4小时，经过一温控单元对该基因芯片作二阶段温控，将该探针与该基因芯片进行杂合反应，取得杂合溶液，其中，该基因芯片系选定一寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于热塑型材质的芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列者，而该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10uM～200uM，序列长度介于40～60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补的关系，该基因芯片将该寡核苷酸溶液以30标准升以上的量，分布于芯片基质上，将寡核苷酸片段重复及排列，干燥后以紫外光照射固化而成；以及讯号侦测步骤：将上述杂合溶液移除，留下该基因芯片于该基因芯片反应与显像区中，利用该基因芯片反应试剂单元中讯号侦测组件所包含缓冲清洗试剂、噪声阻隔试剂及讯号显示剂，对上述移除杂合溶液的基因芯片进行呈色反应，将该基因芯片上杂合后的探针加入由清洁剂及无机盐类所组成的缓冲清洗试剂，于反应后移除，加入由清洁剂及背景抑制配方所组成的噪声阻隔试剂，于反应后移除，再加入该讯号显示剂，反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，于烘干后即得到侦测结果。