[发明专利]一种凝血酶的制备方法

摘要

本发明属于生化制药领域，具体涉及一种凝血酶的制备方法。本发明利用DEAE Sephadex A50凝胶吸附猪血浆预处理，提高了凝血酶的回收率，由于血浆属于复杂料液，除了含有血浆蛋白之外，还含有少量的血细胞或者碎片、脂肪或乳糜颗粒等不溶物，不溶物粒径大小不一，脂肪或乳糜微粒还导致血浆具有较大的粘度，选用Capto Heparin亲和凝胶，因其具有较高的效价回收率，耐压性强，然后进行超滤、病毒灭活，经离子交换层析，纳米膜过滤，一方面最大程度保证其中的病毒得到消除，提高使用的安全性，另一方面得到纯度较高的猪血浆液，排除杂质，为制备高纯度凝血酶提供基础。

主权项

1.一种凝血酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：取鲜猪血浆经DEAE Sephadex A50凝胶吸附，过滤，取滤液A，用洗涤液洗涤Capto Heparin亲和凝胶2~3次，得洗涤后亲和凝胶，取浓度为2mol/L的氯化钠溶液按质量比20：1加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得洗脱液，将滤液过洗涤后亲和凝胶进行亲和层析，用洗脱液进行洗脱，取层析洗脱液按质量比1：5加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液进行超滤，得超滤液；取超滤液按质量比100：1~3：2~4加入聚山梨酯‑80、质量分数为0.3%的磷酸三丁酯水溶液混合，于20~25℃保持4~6h，过Capto Q凝胶进行离子交换层析，再经纳米滤膜过滤，取滤液B，得凝血酶基体液；取凝血酶基体液按质量比10：1加入浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液，于3~4℃搅拌混合30~40min，静置，离心，取沉淀用浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液洗涤2~3次，取洗涤后沉淀按质量比1：5加入混合液，于3~4℃搅拌混合30~50min，离心，取上清液A按质量比5：8：2加入浓度为0.02mol/L的Tris‑HCl缓冲液、0.15mol/L的氯化钠溶液混合，静置，离心，得上清液B；取上清液B按质量比10：3加入质量分数为2%的碳酸钠溶液搅拌混合，保持15~20min，再加入上清液质量20~30%的浓度为0.25mol/L的氯化钙溶液，保持1~2h，调节pH至7.0~7.2，静置，过滤，取滤液，得滤液C；取乳香、没药、裸花紫珠叶按质量比2：2：1混合干燥，粉碎过100目筛，收集过筛颗粒按质量比1：10加入蒸馏水混合，于95~100℃保持1~2h，过滤，取滤液按质量比1：6加入正丁醇萃取，保持1~2h，取萃取液减压浓缩，得浓缩物，浓缩物按质量比2：5加入滤液C混合，冷冻干燥，得干燥粉末，即为凝血酶。