[发明专利]一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法

摘要

本发明公开了一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法。所述的愈伤组织诱导的方法包括以下步骤：1、种子表面消毒；2、种子萌发和愈伤组织的诱导；3、愈伤组织的继代培养。此外，本发明还提出了一种马齿苋细胞的悬浮培养方法，包括：将所述的愈伤组织转入液体培养基中，在摇床转速为100rpm，25℃避光下培养，获得马齿苋悬浮细胞。本发明选用了毒秀定(picloram)作为马齿苋愈伤组织诱导、继代及悬浮培养的诱导剂，同时外植体选用表面消毒的种子直接在诱导培养上进行萌发和愈伤组织的诱导，诱导效率为100％。从愈伤组织的诱导、继代和悬浮细胞培养都选用同一个浓度的毒秀定来进行诱导，方法简单，不需要对外植体进行多次操作，同时避免了褐化现象的发生。

主权项

1.一种马齿苋愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将马齿苋种子用84消毒液进行表面消毒10～15min，期间放置于旋转摇床进行充分混合，在超净工作台中用无菌水对消毒后的种子进行洗涤5次以上，作为外植体备用；

步骤二：表面消毒后的马齿苋种子转移到愈伤组织诱导培养基上进行种子萌发和愈伤组织的诱导，培养条件为长日照，温度为25℃；经过7～10天，马齿苋种子萌发，并且茎叶部位的组织开始被诱导产生愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为含有30g/L蔗糖，4g/L结冷胶，20～40mg/L毒秀定的MS(Murashige‑Skoog)培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8～6.0；

步骤三、将步骤二中诱导产生的愈伤组织切割分离，接种到愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，继代周期为15～20天/次，培养条件为长日照，温度为25℃，得到疏松的愈伤组织。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述的84消毒液的有效含氯量8000～10500mg/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65g/L NH₄NO₃、1.90g/L KNO₃、0.17g/L KH₂PO₄、0.1807g/L MgSO₄·7H₂O、0.332g/L CaCl₂、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、6.20mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、8.60mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂‑EDTA·2H₂O、100mg/L肌醇、0.50mg/L烟酸、0.50mg/L维生素B6、0.10mg/L维生素B1以及2.0mg/L甘氨酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。

6.一种马齿苋细胞的悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

按照权利要求1所述的方法获得的疏松的马齿苋愈伤组织，将该愈伤组织转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，获得马齿苋悬浮细胞；

所述的液体培养基为含有30g/L蔗糖，20～40mg/L毒秀定的MS(Murashige‑Skoog)培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8～6.0。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65g/L NH₄NO₃、1.90g/L KNO₃、0.17g/L KH₂PO₄、0.1807g/L MgSO₄·7H₂O、0.332g/L CaCl₂、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、6.20mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、8.60mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂‑EDTA·2H₂O、100mg/L肌醇、0.50mg/L烟酸、0.50mg/L维生素B6、0.10mg/L维生素B1以及2.0mg/L甘氨酸。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，每100ml液体诱导培养基中接种1g愈伤组织。