[发明专利]一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于筛查肺癌的蛋白芯片的制备方法，通过构建吸烟者肺癌组织T7噬菌体展示cDNA文库，将文库中的cDNA片段插入到T7噬菌体载体中，使插入片段以融合蛋白形式展示在噬菌体外壳蛋白上，将外源蛋白或多肽基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达，通过生物淘洗和噬菌体展示技术制备了蛋白芯片，将病人的异常基因融合表达为异常蛋白，并借助蛋白芯片的高通量筛选和抗原抗体特异性结合的原理来确定肿瘤标志物，本发明的方法可在早期发现或筛查原发肿瘤，筛查肿瘤高危人群，鉴别肿瘤的良恶性，判断肿瘤的发展过程，观察肿瘤的治疗效果，预测肿瘤的复发和预后中发挥重要作用。

主权项

1.一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)建立癌组织cDNA噬菌体展示文库：选择病理资料齐全的若干份癌组织，包括一半的I期及一半的II期癌组织，提取得到总RNA，然后分离得到mRNA；将mRNA作为模板，制备得到两端分别有EcoRI和Hind III粘性末端的双链cDNA；将上述获得的双链cDNA与噬菌体混合，在连接酶的作用下，取连接产物与包装蛋白混合，得到大量具有感染性的噬菌体颗粒，扩增，形成癌组织cDNA噬菌体文库；(2)生物淘洗：通过亲和选择获得靶功能的蛋白或者多肽，进而作为标志物进行开发应用，即从上述文库中获得噬菌体展示文库；2.1G蛋白珠封闭：取两个离心管，分别加入G蛋白琼脂糖珠，用BSA封闭，标记1、2号管；2.2血清包被：将若干份正常人血清混合，稀释后，用其包被1号管，4℃放置1h，将若干份癌病人血清混合，稀释后，包被2号管，4℃放置1h；之后用PBS清洗，离心去上清；2.3生物淘洗：向1号管中加入上述构建的噬菌体文库，将其混合均匀，离心，收集悬浮液，备用，2h后用PBS洗2号管G蛋白琼脂糖珠3次，离心，去上清，将之前步骤收集的悬浮液加入2号管中，混合均匀，4℃放置，然后离心去上清，再用PBS洗脱，离心，收集悬浮液，即为免疫原性噬菌体；2.4淘洗后的富集将淘洗后得到的免疫原性噬菌体加入到BLT5615中，混合均匀，37℃倒置培养，长出噬菌斑；加入噬菌斑提取液，过夜，收集噬菌斑提取液，离心，保存上清；重复进行多轮淘洗、扩增，将最后一轮扩增后的噬菌体‑80℃储存，备用。2.5cDNA文库的稀释铺板；将最后一轮淘洗后的文库一系列梯度稀释，稀释多个梯度，取稀释后的多个文库分别与备用的宿主菌混合，铺板，37℃倒置培养，直到长出清晰的噬菌斑后，4℃保存；(3)芯片构建与高通量筛选：3.1芯片的构建：在孔板中加入BLT 5615菌液，用灭菌牙签挑取单克隆到孔板中，置于摇床培养，离心，分别从每孔中取上清于一新的孔板，用于点样，使用自动点样仪，设置矩阵和间距后进行取样、点样，得若干张蛋白芯片。