[发明专利]石斛叶片复合游离氨基酸的提取方法及用途

摘要

本发明提供了一种从铁皮石斛叶片中提取复合游离氨基酸的方法，包括如下步骤：初步提取铁皮石斛叶片中的游离氨基酸获得初提液，二次萃取提取剩余游离氨基酸，去除蛋白、多糖等杂质并用活性炭吸附除杂、脱色，用酸性阳离子交换树脂纯化游离氨基酸提取液粗品，分子筛进一步纯化，结晶精制，其中获得晶体纯度高达99.5％以上。

主权项

1.一种从铁皮石斛叶片中提取复合游离氨基酸的方法，所述提取方法包括如下步骤：

a.初提：在去离子水中采用超声‑浸取法初步提取铁皮石斛叶片中的游离氨基酸，过滤，获得初提液；

b.二次提取：溶解滤渣，采用双水相萃取体系结合超声法进行二次萃取，提取剩余游离氨基酸，获得二次初提液；

c.除杂：合并初提液和二次提取液，真空浓缩，在双水相萃取体系中进一步萃取纯化，分相，过滤，滤液加入纯化试剂静置过夜，去除蛋白、多糖等杂质，并用活性炭吸附除杂、脱色，从而获得铁皮石斛游离氨基酸提取液粗品；

d.初步纯化：用酸性阳离子交换树脂纯化游离氨基酸提取液，进一步去除低分子量的寡聚糖、多糖等杂质，收集各氨基酸组分洗脱液，脱氨浓缩处理；

e.二次纯化：用吸附树脂类分子筛进一步纯化获得的复合氨基酸洗脱液，除去石斛酚等低分子量杂质，干燥，获得游离氨基酸粗品；其中，所述的吸附树脂类分子筛为聚苯乙烯基聚合物树脂，优选地，为苯乙烯基交联二乙烯苯共聚物树脂；

f.结晶精制：乙醇溶解，真空蒸发结晶获得复合氨基酸晶体粗品；

g.重结晶1‑2次，获得所述的复合游离氨基酸精制晶体，其中所述晶体纯度在99.5％以上。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)具体如下：

将杀青并经烘干粉碎后的铁皮石斛叶片粉末过100‑120目筛，加入10‑40倍质量的蒸馏水，置于闪式提取器中，室温条件下在闪式提取器刀片转速为15000‑20000r/min下初步提取30‑90s，再于水浴振荡器中在50‑60℃下浸提20‑60min，浸提结束后，将浸提液趁热减压抽滤，收集滤液并冷却至室温，作为初提液，滤渣备用。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)具体如下：

(1)配制双水相萃取液：将PEG4000‑8000聚合物加入到磷酸氢二钾‑硫酸钠复合无机盐的水溶液中，配制成聚乙二醇质量分数为5‑8％、复合无机盐质量分数为8‑12％的萃取液；

(2)二次提取：将初提后的滤渣加入20‑30倍质量的萃取液，调pH值为6.8‑7，搅拌均匀，先置于超声波逆流提取器中在40‑50℃下超声提取3‑5次，每次超声提取时间5‑10s，超声提取间隔30‑60s，超声功率设定为300‑400W；然后均匀搅拌5‑10min，提取结束后，趁热减压抽滤，收集滤液并冷却至室温，静置1‑3h分相，游离氨基酸被萃取到上层水相，收集双水相体系的该上层提取液，作为二次提取液，与初提液合并，命名为提取液1；其中，所述萃取液中复合无机盐磷酸氢二钾：硫酸钠的质量比为1:0.5‑1；

优选地，所述静置分相时间为2‑3h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)具体如下：

(1)配制二次双水相萃取液：将PEG‑6000加入到氯化钠‑硫酸钠复合无机盐的水溶液中，配制成聚乙二醇质量分数为2‑3％、复合无机盐质量分数为3‑5％的二次萃取液；

将合并后的提取液1浓缩至原体积的三分之一至四分之一，加入5‑10倍质量的上述二次萃取液，调pH值为7，在温度25‑30℃下均匀搅拌5‑15min，微滤膜过滤，收集滤液并冷却至室温，静置分相1‑3h，舍弃含有蛋白质的PEG层，收集含有氨基酸的水层提取液，命名为提取液2；

(2)过滤除杂：将提取液2真空浓缩至十分之一体积，进行二级过滤：先用0.1‑0.2微米的微滤膜过滤除杂，再用超滤膜去除部分多糖、蛋白等大分子杂质；

(3)除大分子杂质并脱色：将过滤后的滤液加入1‑1.5倍体积的纯化试剂溶液进一步去除残余蛋白和水溶性多糖，4℃静置过夜后以8000‑9000r/min离心15‑20min，取上清液，按10ml：1g的比例加入活性炭搅拌15‑20min吸附除杂并脱色，微滤膜过滤，即得游离氨基酸提取液，将滤液减压浓缩至原体积五分之一至十分之一；

其中，所述萃取体系中复合无机盐硫酸钠：氯化钠的质量比为1:0.2‑0.5；

其中，所述纯化试剂溶液为5‑6％磺基水杨酸溶液或无水乙醇；优选地，选用无水乙醇。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)具体如下：

(1)将获得的游离氨基酸浓缩液调节pH至2.0‑3.0，以流速为2‑4mL/min上样用盐酸处理过的苯乙烯基酸性阳离子交换树脂中，停留15‑30min使氨基酸与树脂结合，先用蒸馏水以3‑5ml/min的速度洗涤交换柱除去杂质，直至无紫外检测信号，其中带负电的残余多糖组分不被吸附而冲洗下来；

(2)然后用1‑2mol/L的氨水以3‑5ml/min的速度洗脱交换柱，出现氨基酸紫外检测信号即开始收集洗脱液，得到复合氨基酸洗脱液，所得洗脱液经旋转蒸发仪浓缩脱氨处理，浓缩至原体积的五分之一至十分之一。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(e)具体如下：

使上步骤获得的氨基酸浓缩液通过去离子水浸泡的粒径为80‑100微米的聚苯乙烯基聚合物树脂，然后用去离子水以5‑8ml/min的速度洗脱树脂柱，掺杂的低分子量杂质被吸附从而除去，依据氨基酸紫外检测信号收集氨基酸洗脱液，50‑60℃下真空干燥，得到纯度在98％以上的复合氨基酸粗品；其中，所述的聚苯乙烯基聚合物树脂优选苯乙烯基交联二乙烯苯共聚物树脂。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(f)‑(g)具体如下：

将上述步骤获得的氨基酸粗品用5‑6倍质量的50‑70％乙醇溶解，加热浓缩到原体积的十分之一，采用真空蒸发结晶，得纯度在99％以上的晶体；将晶体粗品用50‑60％乙醇再次溶解，真空结晶器中重结晶一至两次，得到精制的复合氨基酸晶体，其纯度在99.5％以上。

8.根据权利要求1‑7任一项所述方法得到的铁皮石斛复合游离氨基酸产品。

9.含有权利要求8所述复合游离氨基酸产品的食品、营养补充剂或者药物组合物。

10.由权利要求8所述复合游离氨基酸制备得到的复合氨基酸螯合物，其特征在于，由所述的铁皮石斛复合游离氨基酸与其他微量元素螯合而成。