[发明专利]一种双因子程序释放的仿生取向软骨支架及其制备方法

摘要

本发明公开一种双因子程序释放的仿生取向软骨支架及其制备方法，该仿生取向软骨支架由上下两层材料复合而成，上层表面层复合材料是由胶原、壳聚糖、透明质酸和负载KGN的PLAG微球制成；下层移行层复合材料是由胶原、壳聚糖、丝素蛋白和负载TGF‑β1的聚赖氨酸‑肝素钠（PLL‑HS）纳米粒制成。本发明制备的仿生取向软骨支架综合了胶原良好的生物相容性和生物降解性，壳聚糖的抗菌性和可生物降解性，丝素蛋白的良好力学性能，以及透明质酸的润滑和抗炎作用，对BMSCs具有良好的促进增殖和分化作用，可在修复早、中期KOA软骨缺损的同时达到对KOA症状的缓解和治疗，是一种较理想的骨关节炎软骨缺损修复的医用材料。

主权项

1.一种双因子程序释放的仿生取向软骨支架，其特征在于：以胶原、壳聚糖为主要原料，分别与透明质酸、负载KGN的PLGA微球及丝素蛋白、负载TGF‑β1的PLL‑HS纳米粒配合制备表面层复合材料和移行层复合材料，再以丝素蛋白为粘合剂将两者粘合，制得具有上下双层结构的仿生取向软骨支架。

2.根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架，其特征在于：所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱；所述丝素蛋白从蚕茧中获得。

3.一种如权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

一、表面层复合材料的制备

（1）分别将胶原、壳聚糖溶于冰醋酸，制成胶原溶液和壳聚糖溶液；

（2）将透明质酸溶于水中制成透明质酸溶液；

（3）将步骤（1）所得胶原溶液与壳聚糖溶液漩涡搅拌混合均匀；

（4）将步骤（2）所得透明质酸溶液缓慢加入步骤（3）所得混合液中，混合均匀；

（5）将步骤（4）所得混合溶液磁力搅拌过夜，经冷冻干燥后添加交联剂进行交联；

（6）将交联后的产物用蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得冻干的表面层复合材料；

（7）制备负载KGN的PLGA微球；

（8）将步骤（7）制备的负载KGN的PLGA微球用注射器均匀注射到冻干的表面层复合材料中，并再次冻干，得表面层复合材料；

（9）将步骤（8）所得表面层复合材料用打孔器制成直径5 mm、高2 mm的圆柱体；

二、移行层复合材料的制备

（10）另取胶原、壳聚糖分别溶于冰醋酸，制成胶原溶液和壳聚糖溶液；

（11）制备丝素蛋白；

（12）将步骤（10）所得胶原溶液与壳聚糖溶液漩涡搅拌混合均匀，然后置于磁力搅拌器上缓慢搅拌；

（13）将步骤（11）所得丝素蛋白缓慢加入到步骤（12）所得混合液中，混合均匀；

（14）制备负载TGF‑β1的PLL‑HS纳米粒；

（15）将步骤（14）制备的负载TGF‑β1的PLL‑HS纳米粒加入到步骤（13）所得混合液中均匀混合；

（16）将步骤（15）所得混合溶液磁力搅拌2小时，然后注入到模具中并缓慢竖直放入液氮中冷冻过夜；

（17）将步骤（16）冷冻干燥后的产物于交联剂中进行交联；

（18）将交联产物用蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得移行层复合材料，然后将其切割成长4 mm的柱状；

三、软骨支架的制备

（19）将步骤（9）所得圆柱体状表面层复合材料和步骤（18）所得柱状移行层复合材料用丝素蛋白进行粘合，40℃烘干，即为双因子程序释放的仿生取向软骨支架。

4.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：表面层复合材料的制备中，所用胶原溶液的浓度为0.6 wt%、所用壳聚糖溶液的浓度为1 wt%，所用透明质酸溶液的浓度为1 wt%；三者混合的体积比为1~10:10:1~10。

5.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述交联剂是将2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水合物、1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺溶于体积浓度为40%的乙醇溶液中制得；

其中2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水合物、1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺的摩尔比为50:33:8。

6.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤一所得表面层复合材料中负载KGN的PLGA微球的含量为0.03 wt%。

7.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：移行层复合材料的制备中，所用胶原溶液的浓度为0.6 wt%、所用壳聚糖溶液的浓度为1 wt%、所用丝素蛋白的浓度为1.343 wt%；三者混合的质量比为1:1:0~3。

8.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述负载TGF‑β1的PLL‑HS纳米粒的制备方法如下：

1）将分子量为7000‑15000 Da的PLL溶于去离子水中，制得浓度为1 mg/mL的PLL溶液；

2）将0.4 mg TGF‑β1溶于0.2 mL去离子水中，加入5 mL浓度为1 mg/mL的肝素钠溶液，混合过夜；

3）将步骤2）所得混合液加入到步骤1）所得的PLL溶液中，在旋涡震荡混合器上震荡15 s，然后室温孵化30 min，即得到包载TGF‑β1的PLL‑HS纳米粒。

9.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤（17）中所述交联剂为京尼平。

10.根据权利要求3所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤二所得移行层复合材料中TGF‑β1的浓度为0.102 mg/cm²。