[发明专利]外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种外泌体生物标志物MMP‑13的提取、检测方法及试剂盒，提取、检测方法包括缺氧微环境模型构建、外泌体的提取和纯化、电镜鉴定外泌体、外泌体总蛋白样品制备、凝胶电泳和蛋白质免疫检测等步骤。本发明方法简便、易操作，效果好。 1

主权项

1.一种非诊断用途的外泌体生物标志物MMP‑13的提取、检测方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）缺氧微环境模型构建：采用下列方法之一：

（1）物理缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；1 % O₂、5 % CO₂、94 % N₂，37 ℃条件下培养 24 h，缺氧处理前为细胞更换新鲜培养基；缺氧处理是在密闭容器中以10 L/min 流量充入配制好的混合气体，所述混合气体：vol/vol：95 % N₂、5 % CO₂，持续10 min 后关闭进、出气口，测氧仪测得容器内O2最终体积分数为1 %；

（2）化学缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；在培养基中加入浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl₂用于模拟肿瘤内部乏氧微环境，选取最适浓度用于后续实验；

（二）外泌体的提取和纯化

（1）常氧、缺氧条件下培养的细胞条件培养基在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，500g的离心条件下离心10分钟，分离以去除血液中的细胞，然后得到上层培养基；

（2）将步骤（1）所得上清在4℃、10000g的离心条件下离心60分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液；

（3）将上清液移入新的离心管中，并向其中加入PBS吹打混匀重悬后，在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的外泌体；

（三）电镜鉴定外泌体 


（1）将上述所得到的外泌体用PBS溶液重悬；

（2）滴加 20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液1:1混匀；

（3）取上述混匀液体 5ul滴于载样铜网上，室温下负染10分钟，白织灯下烤干；

（4）透射电镜下拍照鉴定外泌体形态、大小；典型结构：双层脂质膜结构，粒径40 ~ 100nm；

（四）外泌体总蛋白样品制备

（1）以100 μl裂解液重悬沉淀并反复吹打3‑5 min，混匀后于4 ℃冰浴30 min；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；

（2）沸水煮15 min，4℃以12000 g/min离心10 min；

（3）取上清作为外泌体总蛋白质，采用BCA法测定样品蛋白质的浓度，分装后储于‑80℃保存、备用；

（五）凝胶电泳和蛋白质免疫检测

（1）将胶板用蒸馏水冲洗干净，晾干，进行配胶，根据MMP‑13蛋白分子量配置12%的胶；

（2）在电泳槽中加入电泳缓冲液后上样，蛋白含量为20 ug，电泳；安装电极，接上电源，恒压80 V，使蛋白质跑到同一条起跑线上，蛋白质跑至分离胶上时改为120 V；

（3）切胶，放入转膜缓冲液；将PVDF膜放置在甲醇中极化，蒸馏水中水化后放入转膜液，与棉垫及滤纸一起在转膜缓冲液中平衡15 min；

（4）将PVDF膜、胶、棉垫及滤纸制作成“三明治”结构，第一层为棉垫，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为PVDF膜，第五层为滤纸，第六层为棉垫，夹紧；放入转膜槽内，加入转膜液和冰盒，转膜槽放在装满冰水的盆里；安装电极、接好电源，转膜条件设定为恒流300 mA，90 min；

（5）转膜结束后，取出PVDF膜，进行标记，放在摇床上，TBST洗5 min × 3次，5 %脱脂牛奶封闭1~2 h；TBST洗膜5 min × 3次；抗MMP‑13抗体孵育，室温1 h后4 ℃过夜；

（6）TBST洗膜10 min × 3次；抗兔二抗孵育，室温2 h；TBST洗20 min × 3次；

（7）暗室内显影，冲洗X感光胶片；胶片予扫描仪扫描后分析其灰度；对比目的蛋白与内参蛋白Flotilin的灰度值，所得的比值为目的蛋白的相对表达量。

2.一种外泌体生物标志物MMP‑13的提取、检测用试剂盒，其特征是：包括下列材料：

（1）浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl₂；

（2）PBS溶液；

（3）20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液；

（4）100 μl裂解液；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；

（5）转膜缓冲液；

（6）PVDF膜、胶、棉垫及滤纸；

（7）TBST洗液，5 %脱脂牛奶，抗MMP‑13抗体；

（8）抗兔二抗。