[发明专利]外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种外泌体生物标志物MMP‑13的提取、检测方法及试剂盒，提取、检测方法包括缺氧微环境模型构建、外泌体的提取和纯化、电镜鉴定外泌体、外泌体总蛋白样品制备、凝胶电泳和蛋白质免疫检测等步骤。本发明方法简便、易操作，效果好。

技术领域

本发明涉及一种外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测用试剂盒。

背景技术

外泌体是由多种细胞释放的纳米级（直径为50-100nm）的膜结合囊泡，可由肿瘤细胞大量释放。外泌体可存在于多种体液中，比如：各种体液如羊水，腹水，唾液，血清，血浆，乳汁，尿液，脑脊髓液等。外泌体携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等。外泌体通过转运mRNA、miRNA等促进肿瘤的发生，参与肿瘤恶性化进程。不仅如此，外泌体还参与血管生成，帮助肿瘤细胞逃避免疫反应，促进肿瘤的侵袭和转移以及上皮间质化，重塑肿瘤微环境。最近的证据已经强调了缺氧肿瘤细胞释放的外泌体在促进肿瘤进展中的作用。例如在乳腺癌细胞中，缺氧被认为是触发释放外泌体的因素,在缺氧情况下，外泌体可以激活HIF-1α增强细胞的侵袭能力；外泌体可以促使肿瘤微环境酸化，PH值降低；促进肿瘤细胞抵抗辐射能力。鉴于将缺氧微环境和外泌体介导的信号独立连接到侵袭性肿瘤表型的观察结果，研究缺氧是否可能通过改变的外泌体释放来促进肿瘤进展是非常有意义的。

外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测对科学研究是十分重要的，因此建立合适的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法是进行相关科学研究的重要步骤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、易操作的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法及试剂盒。

本发明的技术解决方案是：

一种非诊断用途的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）缺氧微环境模型构建：采用下列方法之一：

（1）物理缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；1 % O₂、5 % CO₂、94 % N₂，37 ℃条件下培养 24 h，缺氧处理前为细胞更换新鲜培养基；缺氧处理是在密闭容器中以10 L/min 流量充入配制好的混合气体，所述混合气体：vol/vol：95 % N₂、5 % CO₂，持续10 min后关闭进、出气口，测氧仪测得容器内O2最终体积分数为1 %；

（2）化学缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；在培养基中加入浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl₂用于模拟肿瘤内部乏氧微环境，选取最适浓度用于后续实验；

（二）外泌体的提取和纯化

（1）常氧、缺氧条件下培养的细胞条件培养基在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，500g的离心条件下离心10分钟，分离以去除血液中的细胞，然后得到上层培养基；

（2）将步骤（1）所得上清在4℃、10000g的离心条件下离心60分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液；

（3）将上清液移入新的离心管中，并向其中加入PBS吹打混匀重悬后，在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的外泌体；

（三）电镜鉴定外泌体

（1）将上述所得到的外泌体用PBS溶液重悬；

（2）滴加 20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液1:1混匀；

（3）取上述混匀液体 5ul滴于载样铜网上，室温下负染10分钟，白织灯下烤干；