[发明专利]一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法

摘要

本发明公开了一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，（1）肝癌大鼠构建和肝脏（2）转录组测序（3）基于iTRAQ联合LC‑MALDI的差异蛋白组学研究（4）生物信息学分析（5）RT‑PCR（6）免疫组化（7）ELISA结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性；（8）数据统计分析方法；本发明采用临床样本对其进行定位定量的表达验证，寻找其与临床相关性的证据，评价临床价值，为肝癌发病学和肝癌机制研究提供新的线索。课题筛选的肝癌关键分子将为探索与早期发现、分类、评价预后相关的肝癌标志物,以及选择更加有效、准确的肝癌治疗靶位奠定研究基础。

主权项

一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，其特征在于：由以下步骤组成：（1）肝癌大鼠构建和肝脏清洁级Wistar 雄性大鼠40 只,体重150 ±20g；随机分为试验组30 只,对照组10 只；按清洁级动物的饲养要求饲养在半屏障系统中；用灭菌的自来水配制浓度为100μgPml 的二乙基亚硝胺溶液(避光保存,新鲜配制) ,供试验组大鼠自由饮用,每天更换一次,3 个月后改为一般的灭菌自来水,继续观察2个月,整个实验过程共5个月；对照组整个实验过程均饮用灭菌自来水；实验截止时注射过量戊巴比妥钠处死动物，打开腹腔,取肝组织用10 %甲醛固定，HE染色后进行病理学镜检,确定大鼠肝癌诱导完成；（2）转录组测序提取正常和肝癌大鼠肝脏总RNA,过程中注意避免RNA酶，测量OD值后确定样本浓度，分别混合正常组和肝癌组大鼠肝脏总RNA，使两个混合样本的RNA含量均在100ug以上，分离纯化mRNA, 使其含量达5‑400ng，构建全转录组文库，制备模板并采用Ion proton系统进行定量测序；（3）基于iTRAQ联合LC‑MALDI的差异蛋白组学研究提取正常组和肝癌组大鼠肝脏总蛋白液，将两组分别混合，采用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀后定量，使每组约含100ug总蛋白，依次进行进行胰酶酶解、还原烷基化、iTRAQ 标记等，过程严格遵照iTRAQ试剂盒说明书进行；将iTRAQ标记后的正常组和肝癌组大鼠肝脏酶解产物等量混合，进行一维SCX和二维nano‑LC色谱分离后，进入质谱仪分析；（4）生物信息学分析分别对转录组测序和差异蛋白组学数据进行数据覆盖度、对比信息统计等，寻找肝癌中转录和蛋白表达均显示差异的分子进行新转录本及注释、表达量分析和差异表达分析、差异表达聚类分析、差异表达基因的功能注释分析等数据挖掘工作，筛选肝癌相关关键功能节点及肿瘤分子；（5）RT‑PCR根据肝癌分子的Accession number，在genebank获得其序列并设计PCR引物；组织提取总RNA，逆转录成cDNA作为PCR模板；依次进行DNA变性、退火和延伸等，具体条件参照引物和试剂说明书；（6）免疫组化组织切片脱蜡、水化后PBS洗2～3次各5分钟；将3% H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟；PBS洗2～3次各5分钟；电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织片片加热10‑15分钟进行沸热修复；PBS洗2～3次各5分钟；滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟；甩去多余液体；滴加1抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（其中，4℃过夜后需在37℃复温45分钟）；PBS洗3次各5分钟；滴加二抗（可加入0.05%的tween‑20）40～50μl，室温静置，或37℃1小时;PBS洗3次各5分钟;DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15分钟；脱水、透明、封片、镜检；（7）ELISA用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml；在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时后洗涤（注意留出空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔）；于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml；37℃孵育0.5～1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；于各反应孔中加入终止液0.05ml；结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性；（8）数据统计分析方法使用SPSS19.0统计软件包，按实际数据类型选择统计分析方法。